水凝胶是一类以共价或非共价键交联的凝聚态物质，含有大量的水作为分散介质，具有三维网络结构[1]，可用于传感、组织工程以及药物载体中[2]。常见的高分子水凝胶，有壳聚糖(Chitosan，CS)、透明质酸(Hyaluronic acid，HA)、聚丙烯酰胺水凝胶(Polyacrylamide，PAM)、聚丙烯酸水凝胶(Polyacrylic acid，PAA)以及聚乙烯醇水凝胶(Poly(vinyl alcohol)，PVA)。PVA水凝胶有优良的组织相容性、较高的含水率、无毒性和易于成型等特点，受到极大的关注[3]。但是，单一PVA水凝胶的力学强度和生物活性不足，不能承受较大的载荷和长时间摩擦，与生物体组织的结合性能也有待提高[4]。近年来研发出一系列具有特殊网络结构的水凝胶，如拓扑水凝胶[5]、主客体超分子水凝胶[6]、纳米复合水凝胶[7,8]以及双网络水凝胶[9]。
纳米复合水凝胶，将纳米尺寸的颗粒分散在水凝胶中以使其性能提高[10]。常用的纳米填充材料，有氧化石墨烯[11]、粘土材料[12]、金纳米簇(AuNCs)和羟基磷灰石[13]。AuNCs是一种典型的可进行活细胞荧光标记的贵金属纳米材料，其尺寸小、制备方法简单且具有良好的生物相容性、低细胞毒性以及荧光特性[14]。临床使用的结果表明，凝胶作为骨修复或替换材料植入人体后，需要实时观测其在体内的降解情况。但是，传统的X射线成像方法对人体的危害较大、价格较贵，且难以直观地实时监测。相比之下，荧光可视化监测安全、快速且廉价。在水凝胶中包埋Au NCs，可使其具有一定的荧光性能，实现对植入物的可视化定位和观察。同时，羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)也是一种良好的纳米填充材料，作为骨骼的主要无机成分，具有优异的的生物相容性、骨传导性以及潜在的骨诱导能力[15]。将HA与PVA水凝胶复合，可改善水凝胶的组织相容性、力学性能和生物活性。
双网络水凝胶是高强度水凝胶的典型代表，具有两种独立的网络结构，一种是交联密度较高的聚电解质网络结构，另一种是低交联或不交联的中性网络结构[16]。这两种网络结构，是两种交联方式或交联主体结合形成的。双网络水凝胶能分散局部应力和结合两个网络耗散能量[17,18]，不仅保持了水凝胶优异的物理性质，还能提高其机械强度。Liu等用化学交联制备双网络水凝胶，甲基丙烯酸酯功能化聚乙烯醇(PVA-MA)为第一重网络，PAM为第二重交联网络。这种双网络水凝胶的压应力承受能力，比单一化学交联的PVA水凝胶高25倍[19]；Gong等通过PAM-co-PAA和PVA制备的双物理交联水凝胶，具有优异的力学性能[20]：共聚物因氢键相互作用而形成链缠结，构成第一网络；PVA冻融处理后形成第二物理交联网络。
水凝胶的交联方式，分为化学交联和物理交联。化学交联是在交联剂或辐射等的作用下高分子链之间通过化学键相互连接，最终形成网络结构[21]。化学交联采用醛类作为交联剂与PVA发生羟醛缩合反应，其中戊二醛是一种比甲醛更有效的交联剂，能使PVA产生更加紧密的结构，交联效果也更好。但是，提高戊二醛的含量不仅影响水凝胶的生物相容性，还使PVA的结晶度逐渐降低，减小其初始存储模量[22]。而物理交联方式简单、温和且不残留有毒交联剂，其中最常用的是循环冷冻-解冻法[23,24]。这种方法可在凝胶内直接形成物理交联点，无需引入任何化学试剂，不会降低凝胶的生物相容性，所制凝胶含水量高且弹性好。但是，单靠循环冷冻-解冻法交联的水凝胶强度低，韧性和热稳定性差[19,25,26]。鉴于此，本文先用化学交联和掺杂纳米材料的方法制备Au NCs/HA/PVA复合水凝胶，并通过循环冷冻-解冻方法进一步使该水凝胶得到第二重交联网络，最终制备出纳米材料填充的化学和物理双重交联的复合水凝胶。
1 实验方法
1.1 Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的制备
用牛血清白蛋白介导合成法制备Au NCs。先配制10 mmol/L的氯金酸溶液(分析纯)和50 g/L的牛血清白蛋白(BSA)(分子生物学级)溶液，然后在37℃将10 mL配制好的氯金酸溶液加到同等体积的BSA溶液中，充分搅拌2 min后加入1 mL的1 mol/L NaOH溶液(分析纯)，将混合溶液在37℃搅拌12 h得到Au NCs，置于4℃棕瓶中保存。
采用化学交联和冷冻-解冻法制备Au NCs/HA/PVA复合水凝胶。将0.455 g聚乙烯醇(PVA，聚合度1700，醇解度99%)粉末和0.1 g纳米羟基磷灰石(HA，生物医药级)粉末加入去离子水中，然后将混合物置于95℃恒温磁力搅拌器中加热搅拌直至完全溶解。在其中加入配好的Au NCs溶液充分搅拌，再滴加稀盐酸(优级纯)调节pH值至2~3，调节温度至20℃以下，加入0.13 mL戊二醛(分析级)搅拌均匀，置于超声波清洗机中除去气泡，最后将复合材料浇注于入模具中置于水浴锅加热到55℃直至交联完成。随后将制备好的复合材料在-20℃冷冻10 h，取出后在室温下解冻14 h。重复上述步骤，分别循环冷冻解冻处理0、5、9次。
1.2 Au NCs的荧光光谱表征和SEM观察
在硅片上滴加少量Au NCs溶液，风干后得到待测样品。在其表面喷金40 s，用扫描电镜(JSM-7100F)观察样品的形态结构。使用荧光分光光度计(Horiba fluoromax 4)测试水凝胶的激发和发射光谱。将不同Au NCs含量的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶制成直径1 cm、高1 cm的圆柱体，放入紫外仪(WD-9403)中观察其荧光表现。
1.3 Au NCs/HA/PVA复合水凝胶力学性能的测试
使用直径1cm、高1cm的圆柱体试样，用INSTRON 3343万能试验机测试其力学性能。在拉伸实验的速率为30 mm/min，压缩实验的速率为40 mm/min，将试样压缩至初始长度的80%。应变和应力分别为
和
其中ε为应变，σ为应力，F为压力，A为受力面积，L为拉伸长度，L0为凝胶初始长度。
1.4 Au NCs/HA/PVA复合水凝胶溶胀性能的测试
将制备出的复合水凝胶放在-25℃低温冰箱中冷冻过夜，冻干前再置于-90℃低温冰箱中冷冻1 h，冷冻完成后在-80℃冷冻干燥机中冷冻干燥8 h。取出后称其干重，再将干凝胶放入盛有去离子水的烧杯中进行溶胀。每隔一段时间取出样品进行称重，称重前用滤纸吸干表面的自由水，直到样品重量不变后停止试验。不同时刻的溶胀率为
其中W0为初始时干凝胶的质量，Wt 为t时刻水凝胶的质量。
2 结果和讨论
2.1 Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的荧光特性
Au NCs/HA/PVA水凝胶网络结构，如图1所示。
图1
图2
图3
从图4可见，将Au NCs填充入水凝胶中后，在自然状态下，随着Au NCs含量的提高Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的颜色由最初的透明逐渐变为浅黄色。在365 nm紫外光照射下，含有Au NCs溶液的复合水凝胶发射红色荧光。当Au NCs与PVA的质量比分别为0%、1.0%、2.6%、4.8%和5.3%时，随着Au NCs含量的提高水凝胶的荧光发射强度逐渐提高。结果表明，Au NCs/HA/PVA复合水凝胶具有明显的荧光特性。
图4
图4
在自然光和紫外光照射下不同Au NCs含量的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的照片
Fig.4
Au NCs/HA/PVA composite hydrogels with different Au NCs contents under natural light (a) and ultraviolet light (b)
2.2 Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的力学性能
2.2.1 Au NCs含量对Au NCs X /HA0.1/PVA复合水凝胶力学性能的影响
图5、图6和图7给出了水凝胶的拉伸力学性能与Au NCs含量的关系。可以看出，随着Au NCs含量的提高Au NCs X /HA0.1/PVA(X=0%~5.3%)复合水凝胶的弹性模量、断裂能以及断裂强度均呈现出先增大后减小的变化趋势。在水凝胶中不添加Au NCs，HA/PVA复合水凝胶的弹性模量仅为26.96 kPa，拉伸强度约为73.97 kPa，断裂能约为83 kJ/m3，当X为2.6%时其弹性模量、断裂能和断裂强度最大，分别达到63.09 kPa、152 kPa、130 kJ/m3。图8为不同Au NCs含量的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶压缩时的弹性模量。图8表明，随着Au NCs含量的提高其压缩弹性模量呈现骤降再缓慢上升的过程。不掺杂Au NCs的HA/PVA复合水凝胶，其弹性模量为914.35 kPa，添加Au NCs后其弹性模量下降到487.95 kPa，随后又缓慢提高。
图5
图5
不同Au NCs含量的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的断裂能
Fig.5
Fracture energy of Au NCs/HA/PVA composite hydrogel with different Au NCs content
图6
图6
不同Au NCs含量的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的断裂应变
Fig.6
Fracture stress of Au NCs/HA/PVA composite hydrogel with different Au NCs content
图7
图7
不同Au NCs含量的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶拉伸时的弹性模量
Fig.7
Elastic modulus of Au NCs/HA/PVA composite hydrogel with different Au NCs content during tensile
图8
图8
不同Au NCs含量的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶压缩时的弹性模量
Fig.8
Elastic modulus of Au NCs/HA/PVA composite hydrogel with different Au NCs content in compression
以上结果表明，加入一定量的Au NCs提高了相同拉伸位移时Au NCs/HA/PVA复合水凝胶所能承受的拉力。总之，Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的拉伸力学性能随Au NCs含量的提高而提高。其原因是，PVA和HA上有许多羟基，而Au NCs的稳定剂牛血清蛋白上有氨基与羧基，随着Au NCs含量的提高凝胶内部的交联点增多，基团之间的氢键相互作用增大，复合水凝胶的交联密度增加，使其稳定性提高。但是，当Au NCs含量高于2.6%时，复合水凝胶的力学强度又显著降低。其原因是，过多的Au NCs使高分子链局部严重缠结，降低了网络结构的均匀性而产生显著的应力集中，从而使凝胶的力学性能降低。这一结果，也在图9中得到了证实。复合水凝胶的压缩力学性能先降低后提高，可能是过多的Au NCs使其压缩弹性模量骤降；但是Au NCs毕竟是一种纳米增强材料，会在一定程度上提高复合水凝胶的刚性，因此其压缩弹性模量有所提高。
图9
2.2.2 冷冻-解冻循环次数对Au NCs2.6/HA0.1/PVA复合水凝胶力学性能的影响
图10~图13给出了冷冻-解冻循环次数对复合水凝胶力学性能的影响。可以看出，随着冷冻-解冻循环次数的增加水凝胶的拉伸力学强度显著提高。不进行冷冻-解冻循环时(N=0)，Au NCs2.6/HA0.1/PVA复合水凝胶的弹性模量、断裂强度以及断裂能仅为45.92 kPa、143.50 kPa和15.42 kJ/m3；而冷冻-解冻循环次数达到9次时(N=9)Au NCs2.6/HA0.1/PVA复合水凝胶的力学性能显著提高，其弹性模量达到308.28 kPa，断裂强度达到795.81 kPa，断裂能达到58.52 kJ/m3。其原因是，未进行冷冻-解冻循环水凝胶只是化学交联的单网络水凝胶，而冷冻-解冻循环使水凝胶产生了第二种交联。在单网络水凝胶的缠结链上形成新的缠结点，PVA分子链上和分子链之间的氢键和范德华力产生了更为强健的物理交联网络，基体的交联度进一步增加，从而成为结构更为致密稳定的物理-化学力共同作用的双网络水凝胶。同时，随着冷冻-解冻循环次数的增加Au NCs2.6/HA0.1/PVA复合水凝胶中更多的自由链参与物理交联，形成更多的交联点，最终使凝胶具有更高的强度和更多有效耗散能量的途径，保护其结构不受破坏。在宏观上，Au NCs2.6/HA0.1/PVA复合水凝胶的力学性能随着冷冻-解冻循环次数的增加而提高。
图10
图10
不同次数冷冻-解冻循环的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的断裂能
Fig.10
Fracture energy of Au NCs/HA/PVA composite hydrogel after different freezing thawing cycles
图11
图11
不同次数冷冻-解冻循环的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的断裂应变
Fig.11
Fracture stress of Au NCs/HA/PVA composite hydrogel after different freezing thawing cycles
图12
图12
经过不同次数冷冻-解冻循环的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶拉伸时的弹性模量
Fig.12
Elastic modulus of Au NCs/HA/PVA composite hydrogel after different freezing thawing cycles during tensile
图13
图13
经过不同次数冷冻-解冻循环的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶压缩时的弹性模量
Fig.13
Elastic modulus of Au NCs/HA/PVA composite hydrogel after different freezing thawing cycles in compression
2.3 Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的溶胀率
由图14可见，随着凝胶中Au NCs含量的提高Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的平衡溶胀率逐渐提高，Au NCs含量为0%、2.6%和5.3%的凝胶，其平衡溶胀率分别为70.03%、80.72%和153.81%，且均在约80 min达到溶胀平衡。较多的Au NCs使水凝胶中通过氢键和范德华力等相互作用逐渐产生了物理交联网络，在水凝胶中生成了更多的微孔，从而使水凝胶能容纳更多的自由水，因此Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的溶胀率提高。
图14
图14
不同Au NCs含量的Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的溶胀比率与时间的关系
Fig.14
Change of swelling ratio of Au NCs/HA/PVA composite hydrogel with different Au NCs content over time
同时，Au NCs/HA/PVA复合水凝胶的含水率约为80%，而人体关节软骨的含水率为60%~80%，且复合水凝胶亲水性好，使凝胶在人体体液中保持良好的性能。
3 结论
以PVA为原料，将以戊二醛为交联剂的化学交联作为第一重交联网络，将冷冻解冻循环物理交联作为第二重交联网络，采用共价键和微晶、氢键共同增强策略，可制备出力学性能优良的双网络Au NCs/HA/PVA复合水凝胶。这种复合水凝胶的强度高，含水率与人体软骨组织相近，在近红外照射下具有荧光特性。这种复合水凝胶的力学性能随着冷冻解冻循环次数的增加而提高，随着Au NCs含量的提高呈现先增大后降低的趋势，Au NCs与PVA质量百分比为2.6%、冷冻-解冻循环9次后其性能最优，其拉伸弹性模量、断裂强度以及断裂能分别达到63.09 kPa，152.84 kPa和130.36 kJ·m-3，含水率在80%左右，与人体软骨组织相近，且表现出显著的荧光性能。
参考文献
A nanocomposite interpenetrating hydrogel with high toughness: effects of the posttreatment and molecular weight
[J].
Mulberry-like polyaniline-based flexible composite fabrics with effective electromagnetic shielding capability
[J].
PVA/Agar Interpenetrating network hydrogel with fast healing, high strength, antifreeze, and water retention
[J].
Novel cross-linking concept of polymer network: synthesis, structure, and properties of slide-ring gels with freely movable junctions
[J].
Polyaniline-decorated supramolecular hydrogel with tough, fatigue-resistant, and self-healable performances for all-in-one flexible supercapacitors
[J].
Pressure and microwave sensors/actuators based on smart hydrogel/conductive polymer nanocomposite
[J].
Poly (vinyl alcohol)/cellulose nanowhiskers nanocomposite hydrogels for potential wound dressings
[J].
Highly stretchable and transparent double-network hydrogel ionic conductors as flexible thermal–mechanical dual sensors and electroluminescent devices
[J].
Biomedical applications of polymer-composite materials: a review
[J].
Graphene oxide/PVA inorganic/organic interpenetrating hydrogels with excellent mechanical properties and biocompatibility
[J].
Versatile poly (vinyl alcohol)/clay physical hydrogels with tailorable structure as potential candidates for wound healing applications
[J].
Wide-range stiffness gradient PVA/HA hydrogel to investigate stem cell differentiation behavior
[J].
Oxidase-like catalytic activity of Cys-AuNCs upon visible light irradiation and its application for visual miRNA detection
[J].
Self-assembled high-strength hydroxyapatite/graphene oxide/chitosan composite hydrogel for bone tissue engineering
[J].
Double network hydrogel with high mechanical strength: Performance, progress and future perspective
[J].
High‐flexibility, high‐toughness double‐cross‐linked chitin hydrogels by sequential chemical and physical cross‐linkings
[J].
Extreme properties of double networked ionogel electrolytes for flexible and durable energy storage devices
[J].
Highly compressible and superior low temperature tolerant supercapacitors based on dual chemically crosslinked PVA hydrogel electrolytes
[J].
Double‐network hydrogels with extremely high mechanical strength
[J].
Research progress of hydrogel and its application in biomedicine
[J].
水凝胶的研究进展及在生物医学方面的应用
[J].
Research progress in preparation methods of PVA hydrogels
[J].
PVA水凝胶制备方法研究进展
[J].
Flexible and low temperature resistant double network alkaline gel polymer electrolyte with dual-role KOH for supercapacitor
[J].
Enhancing the properties of conductive polymer hydrogels by freeze-thaw cycles for high-performance flexible supercapacitors
[J].
Crack tip stress based kinetic fracture model of a PVA dual-crosslink hydrogel
[J].
High-strength, tough, fatigue resistant, and self-healing hydrogel based on dual physically cross-linked network
[J].
