目前临床用种植体和骨科植入物主要是钛及钛合金，其中具有优异机械加工性能、力学性能和生物相容性的Ti-6Al-4V应用最为广泛^[1]。现代医学在外科种植治疗等方面取得了巨大进展，但是种植体术后感染仍然是口腔种植体修复及骨科治疗失败的关键^[2]，每年术后细菌感染导致的种植体修复失败率高达10%^[3]。钛合金是一种生物惰性材料^[4]，没有抗菌功能。因此，使钛合金具有一定的抗菌功能以更好地应用于临床，是医用钛合金的重要研究方向之一。为了实现钛合金的生物功能化，可添加某些金属离子到金属表面的涂层，通过金属离子的释放达到相应的医学功能效果。例如，将Mg元素加入到磷酸三钙陶瓷中^[5]，将Zn元素加入到羟基磷灰石中^[6]，将Sr元素加入到硅酸钙陶瓷中^[7]。铜是一种抑菌性固体材料，含Cu合金能在2 h内杀灭几乎全部的超级病菌MRSA ^[8]。Ti-xCu系列和Ti-6Al-4V-xCu系列钛合金都具有抗菌和杀毒性能，其中Ti-6Al-4V-5Cu合金对金黄色葡萄球菌的杀灭率高达98%^[9]。同时， Ti-6Al-4V-5Cu还具有良好的血液相容性^[10,11]和明显的促成骨功能^[11]。

目前制造口腔种植修复下部结构种植体的常规工艺是铸造法。铸造法是一种减成法，操作复杂，成本高且污染环境。选择性激光熔化(SLM)快速成型技术是一种增材制造方法，已经得到了广泛的应用。控制SLM技术的激光功率、扫描速度、扫描空间以及预热温度等参数，可使用SLM装置对钛合金合金粉末进行覆盖和熔化^[12,13]，缩短制造周期并避免成型过程中的环境污染。这种个性化设计加工，有利于种植义齿技术的普及和推广。同时，3D打印合金的硬度、脆性以及弹性模量都优于传统铸造合金，其中弹性模量的改善尤其具有临床意义^[12,14]。同时，用SLM技术还可以解决临床上大批牙槽骨形态不良、用标准种植体号系无法种植修复的难题^[15]。鉴于此，本文制备3D打印新型含铜钛合金Ti-6Al-4V-5Cu，深入研究其抗菌性能和体外生物相容性。

实验用设备：3D打印(SLM)设备(FS271M)。HERAcell 150细胞培养箱(Thermo Scientific)；TDZ5-WS高速离心机；Infi-nite200酶标仪和TE2000-S倒置相差显微镜。

使用SLM技术制备3D打印新型含铜钛合金Ti-6Al-4V和Ti-6Al-4V-5Cu。两种钛合金的成分列于表1，合金粉末的粒度为15~53 μm。3D打印参数：扫描速率1000 mm/s，扫描间距0.1 mm,激光温度1500℃和铺设厚度0.2 mm/层。

将制备的3D打印Ti-6Al-4V和3D打印Ti-6Al-4V-5Cu样品分别记作TC4和TC4-5Cu。将合金试样切割成直径为10 mm高度为1 mm的圆柱片。为了比较，制备相同尺寸的铸造临床医用级Ti-6Al-4V合金样品，记做tc4。

设置3D打印合金组为实验组，铸造合金组为对照组。依次用150#、600#、1000 #、2000 #水磨砂纸打磨。实验前将样品用75%无水乙醇超声清洗20 min，100%无水乙醇超声清洗20 min，经高温高压灭菌后备用。

用平板计数法、使用革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(ATCC 25923)评价3D打印TC4-5Cu合金样品的抗菌性能。将这种细菌的冷冻粉溶解在pH值为7.2的LB培养基(牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L,氯化钠5 g/L)中，在温度为37℃的摇床中培养24 h得到细菌悬浮液。将细菌悬浮液涂布在营养琼脂平皿(牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L,氯化钠5 g/L,琼脂23 g/L)上，置于湿度高于90%温度为37℃的恒温培养箱中培养24 h。然后取细菌菌落用PBS配制浓度为10⁸ cfu/mL的细菌悬液, 并将其浓度稀释至10³ cfu/mL。取稀释后的菌液50 μL滴加在样品表面，使菌液滴均匀铺开完全覆盖样品表面。每组4个平行样品，在湿度大于90%温度为37℃的恒温培养箱中继续培养24 h。然后将每一个样品连同菌液一起取出依次移入相应的无菌离心管内。加入适量PBS并涡流震荡1 min后取100 μL菌液均匀涂布在固体培养基上，置于培养箱中培养24 h，然后进行菌落计数。实验材料杀菌率为

(1)R(%)=(N-N1)/N×100%

式中R为抗菌率(%)；N为铸造合金对照组样品的菌落数；N₁为3D打印合金实验组的菌落数。

将MC3T3-E1细胞用完全α-MEM培养基(含10% FBS和1%青/链霉素)培养至对数期，消化后配制成浓度为20000个/mL的细胞悬液。三种钛合金每组设置5个平行样品，置于48孔板中，用PBS将样品充分清洗后弃净PBS。每孔加200 μL完全培养基浸没样品，静置1 min，每孔接种500 μL细胞悬液，在37℃恒温恒湿CO₂培养箱中分别培养1、3、7 d。到达时间点后弃培养基，用PBS清洗2次后每孔加入含有10% CCK-8的无血清α-MEM培养基，在避光培养箱中继续孵育4 h后每孔取100 μL测其OD值，根据公式(2)计算细胞增殖率(RGR)，评价细胞毒性等级，等级标准列于表2。

(2)RGR(%)=ODexperimentalgroup/ODcontrastgroup×100%

其中RGR为细胞增殖率，OD为450 nm处的吸光度。

实验组、对照组及每组内平行样品设置同增值测定。在相同条件下进行细胞接种后，分别培养4 h和24 h。到达时间点后将样品取出并移入新的24孔板中，用PBS轻洗2次,4%多聚甲醛固定10 min，PBS再次轻洗，0.2%Triton透膜处理6 min，罗丹明-鬼笔环肽避光染色40 min，PBS再次轻洗2次，DAPI避光染色5 min，PBS再次清洗2次，最后荧光显微镜下拍照统计分析。

实验组、对照组及每组内平行样品设置同增值测定实验，在相同条件下细胞接种后将每孔接种细胞量提高到5万，放在37℃恒温恒湿CO₂培养箱中培养72 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞。将每3个孔的细胞收集到一个离心管内，在4℃以1000 r/min的转速离心分离5 min后弃上清。用冷PBS轻吹重悬后在4℃以1000 r/min的转速离心分离5 min后弃液，每管加入100 μL的Binding Buffer轻吹重悬。然后每管依次加入AnnexinV-FITC、PI 各5 μL，避光反应15 min后，每管加入400 μL的Binding Buffer，轻吹重悬后上机检查。所有实验重复3次。

使用SPSS 22.0 software软件对数据进行统计学处理，对CCK-8结果采用Two-way ANOVA分析，对流式分析采用Ordinary one-way ANOVA分析，P<0.05的差异具有统计学意义。

金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球菌，是最常见和具有代表性的致病菌种之一^[16]。图1a、b给出了3D打印TC4-5Cu组的部分结果，可见菌落稀疏，色泽金黄，形状圆钝；图1c~f分别给出了TC4合金组与tc4合金组的部分结果，可见菌落密集茂盛，色泽金黄，形状圆钝。

结合表3的统计结果说明，与TC4和tc4相比TC4-5Cu具有抗菌能力，其抗菌率高达(57.03±1.55)%。其原因是，TC4-5Cu中的重金属铜离子具有杀菌能力^[17,18]。超过65%的细菌感染与在植入物表面形成的细菌生物膜有关，是植入物感染的原因^[19,20]。细菌先附着在植入物表面，然后与丝氨酸内酯交换分子间的信息，同样的细菌聚在一起。内酯浓度的提高使细菌中的一些基因激活，分泌出的蛋白质构成另一种细胞基质，最终形成完整的细菌生物膜^[20]。合金中具有强且广谱抗菌功能的铜离子能吸收细菌中的RNA和DNA抑制基因复制和细胞内的钙调蛋白，诱导细菌生物膜的破坏，达到抗菌效果^[21]。Ti-6Al-4V-5Cu合金对金黄色葡萄球菌的杀灭率为98%^[9]。虽然使用相同比例的合金粉制备的3D打印合金的杀灭率与其相比有所降低，但是仍然达到57.03%。杀灭率下降的原因，可能是3D打印工艺抑制了Cu离子的释放。例如，工艺中合金粉的层铺厚度过大、制备温度不稳定或冷却速度过高。

2.2.1 CCK-8细胞增殖

新型生物医用材料在应用于临床前都进行规范的细胞毒性等级测定^[22]，只有其毒性等级满足相应要求才能进行功能检测。CCK-8试剂盒是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的高灵敏度试剂盒，主要原理是WST-8可以被线粒体内的脱氢酶还原形成橙黄色formazan，其OD值与活细胞数线性相关。

图2和表4给出了吸光度值和RGR值评级；表4中的数据表明，随着共培养时间增加样品表面的细胞都增殖了，TC4-5Cu和TC4合金组的细胞相对增殖率均高于89%，每一节点的结果中TC4-5Cu合金组都优于对照tc4合金组，但是TC4合金组没有表现出这一特性。图2中的柱状图随着共培养时间增加而增高，分析每一时间点3D打印实验组都高于对照组，统计学分析P＞0.05。这些结果证明，TC4-5Cu，TC4合金与tc4合金组之间共培养后MC3T3-E1细胞增值没有显著的统计学差异。

结合表2中的数据可知，3D打印新型含铜合金TC4-5Cu及3D打印不含铜合金TC4的毒性等级，均处于1之下，符合外科手术器械植入标准。同时，长期临床实验证明Cu是人体必须微量元素，参与细胞代谢和催化作用等生理功能^[23]。铜元素独特的生理安全性能，使其在含铜药物、放射性药物和医用材料中得以广泛应用，长期以来一直用于临床治疗医疗产品。例如:血管疾病治疗中的铜针潴留、肿瘤治疗中铜环与血管的结扎、Cu宫内装置^[24]。CCK-8细胞增值分析测定结果说明，在临床医用铸造tc4合金中添加适量的铜元素，3D打印合金TC4-5Cu的细胞毒性与临床医用铸造tc4合金相同，都具有良好的体外细胞生物相容性，符合外科手术器械细胞毒性植入标准。

2.2.2 细胞骨架染色

真核细胞胞中有错综复杂的纤维网，称为细胞骨架^[25]。根据纤维的直径又分为微丝、微管和中间纤维。对细胞骨架的描述可反应细胞的形态学变化。鬼笔环肽双环杆肽与微丝有强烈的亲和作用，使F-actin稳定。因此使用罗丹明鬼笔环肽进行细胞胞质染色，用DAPI染色剂对细胞核染色，能在荧光显微镜下清晰看到细胞骨架情况。

图3a1、b1、c1给出了三种合金与MC3T3-E1细胞共培养4 h细胞状态部分结果。可见细胞还未完全伸展，微丝微管结构不明显，细胞核核形完整，染色质均匀，细胞开始伸出伪足，视野内未见溶解细胞；对比细胞核染色结果发现，与TC4-5Cu合金共培养的细胞无论是数目还是伸展程度都明显优于TC4合金组和tc4合金组。

图3a2、b2、c2给出了共培养24h的三种合金对MC3T3-E1细胞状态部分结果。从图3a2可见，TC4-5Cu合金组细胞完全伸展，伪足多且清晰，细胞胞核没有明显的改变，可清晰分辨细胞中的微丝微管结构，微丝之间已经建立良好的接触形成完整网络为细胞进一步增殖准备好了结构基础。但是，TC4和tc4组中的细胞虽然基本伸展，但是细胞间微丝的连接却很一般，需要比较长的时间才能达到最佳状态。这些结果表明，与对照组临床医用铸造tc4合金相比，3D打印工艺没有改变合金的生物学性能，是铜离子促进了细胞快速粘附铺展和增殖。

2.2.3 细胞凋亡

细胞凋亡是细胞的程序性死亡，是细胞的基本特征之一，反映细胞的活性状态^[26]。细胞膜表面的磷脂酰胺(Ps)从细胞膜内转移到膜外，使Ps暴露在细胞膜外表面。发生凋亡时细胞膜完整，细胞坏死时细胞膜不再完整^[27]。因此，本文用Annexin V/FITC结合PI染剂进行流式双染分析判断细胞状态。

在图4a~c给出的双变量流式细胞仪散点图上，第一象限表示非活细胞即坏死细胞(FITC+/PI+)，第三象限表示活细胞(FITC-/PI-)，第四象限表示凋亡细胞(FITC+/PI-)。其中图4a给出了3D打印TC4-5Cu合金组流式分析散点图部分结果；图4b和c给出了3D打印TC4组和铸造tc4合金组部分散点图结果。可以看出，收集到的细胞主要为活细胞，3D打印合金与对照组的结果没有特别明显的不同。

对散点图的结果的统计分析，如图4d所示。图4B中的柱状图之间没有明显的差别，统计分析P>0.05。这表明，3D打印合金与对照组的存活细胞没有统计学差异。

图4e给出了凋亡细胞统计结果，3D打印TC4-5Cu合金的柱状图远低于对照组，统计分析P<0.05有统计学差异。但是3D打印TC4组与对照组相比P大于0.05，没有统计学差异。这一结果说明，3D打印工艺不抑制细胞凋亡。结合Ren等^[28]的研究结果，可能是铜离子抑制了细胞凋亡，铜改善了细胞的生存微环境，抑制了细胞凋亡和坏死。铜离子作用于细胞凋亡的两个核心途径包括外在死亡受体途径和内在的线粒体途径中的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)^[29]，通过抑制稳定的中性亲脂性铜络合物形成复杂的复合物转运，从而抑制了caspase-3和caspase-8的活性，发生了切割形式改变进而使细胞凋亡率下降^[30,31]。综上所述，与临床医用铸造tc4合金相比，3D打印TC4-5Cu合金能抑制细胞凋亡。

新型3D打印含铜钛合金Ti-6Al-4V-5Cu对金黄色葡萄球菌具有抗菌功能，其抗菌率高达57.03%。与临床使用的铸造tc4合金相比，3D打印钛合金Ti-6Al-4V-5Cu具有更优异的体外生物相容性。