用于人体组织修复的金属材料植入人体后, 在空气中自发形成的表面氧化膜将与人体生理环境发生反应, 材料与组织之间界面的性质决定了金属的耐蚀性以及金属离子释放的程度, 从而决定了材料的生物相容性^[1]。人体生理环境由Na⁺、K⁺、Ca²⁺和Mg²⁺等金属阳离子, Cl^-、HCO₃^-和HPO₄²等阴离子以及蛋白质、细胞、酶和激素等有机化合物构成。植入人体内的金属表面最先与体内的血液和组织液相接触, 在数秒钟之内继水与无机盐离子在表面吸附后, 体液中的蛋白质分子便吸附于材料表面, 形成厚度约几纳米至几十纳米的蛋白质吸附层^[2-4]。这一蛋白质吸附层不仅会影响金属表面的凝血、细胞及细菌黏附等行为, 也将对金属植入物的腐蚀行为产生影响^{[5, 6]}。

人体内的大量无机盐和蛋白质, 尤其是高氯离子浓度(~103 mmol/L), 会导致植入金属表面钝化膜的成分与厚度发生变化^[7-12]。钝化膜的溶解与重构不仅会影响材料在体内的腐蚀行为, 也将影响到材料的生物相容性。Hanawa等^[9]研究了Co-Cr-Mo合金在几种模拟人体生理环境中浸泡后合金表面氧化膜的性质, 发现在去离子水中机械抛光后的合金表面氧化膜厚度约为2.5 nm, 主要由Co²⁺、Cr³⁺、Mo⁴⁺、Mo⁵⁺和Mo⁶⁺等构成; 而在Hanks溶液和细胞培养液中浸泡以及在L929细胞中孵育后, Co元素从合金中溶出, 表面氧化膜主要为Cr₂O₃和少量Mo的氧化物, 在最外表层有磷酸钙形成。Hiromoto等^[11]的研究表明, 在含有氨基酸、血浆蛋白和细胞的模拟体液中, 纯Ti表面因磷酸钙的沉淀使氧化膜增厚。但Hang等^[12]发现, Ni-Ti合金在磷酸盐缓冲液(PBS)中浸泡200小时后表面氧化膜的厚度达到17 nm, 而在含蛋白质的胎牛血清中浸泡后， 氧化膜的厚度反而下降至10 nm。

显然, 体外模拟生理环境的化学成分显著地影响着材料表面膜的性质, 这对于理解材料在生理环境下的腐蚀行为和生物相容性至关重要。然而, 现有的研究工作对金属在人体真实血液中化学稳定性的了解很有限。Schille等^[13]比较了多种Mg合金在全血和PBS中的腐蚀行为, 发现在PBS中浸泡后的合金表面形成明显的腐蚀产物层, 而在真实血液中浸泡后的合金反而出现不同程度的减重。用这两种介质评价Mg合金耐蚀性的排序, 甚至可能出现相反的结果。由此可见, Mg合金在体外条件下耐蚀性的排序与溶液介质的选择有关。因此, 金属材料在体外模拟环境与在体内真实情况下的腐蚀行为能否自洽仍然存在疑问。

Tanaka等^[14]发现, 在316L不锈钢、Co-Cr-Mo合金以及Ti合金的表面始终存在有厚度为2-5 nm的氧化膜, 其化学成分影响血液中的蛋白质以及血小板在材料表面的吸附程度。Kanagaraja等^[15]的研究表明, 纯Ti和纯Au在血浆中浸泡1分钟后即可在表面观察到纤维蛋白原、免疫球蛋白和白蛋白的吸附, 并且不同类型蛋白质的吸附量与浸泡时间和材料的表面状态有关, 最终会影响金属表面的血小板吸附和细胞应答。而血小板在材料表面的粘附、铺展和活化可能诱发血栓形成, 导致植入器械的功能失效。

目前临床上应用的心血管支架材料, 主要为高磁化率的316L不锈钢、Co-Cr合金和Ni-Ti形状记忆合金等。这些具有铁磁性元素的金属在进行影像学检测时会不同程度地在磁共振影像(MRI)上产生伪影, 误导诊断^[16-19]。另外, 这些材料在人体血液中长期驻留后， 会不同程度地释放出Ni、Co、Cr和Mo等毒性离子。这些毒性离子进入周围组织中可能诱发局部免疫反应及炎症反应, 导致血管内膜增生和再狭窄^{[20, 21]}。因此, 亟待研制在力学、耐腐蚀、生物相容、X射线可视和MRI兼容等综合性能更优异的新型合金。为此, Nb合金作为血管支架材料受到人们的关注^{[22, 23]}。

本文作者最近的研究表明^{[24, 25]}, Nb-60Ta-2Zr合金的力学性能、耐腐蚀、MRI兼容、血液相容性等综合性能优异。但对该合金在体外模拟生理环境中表面氧化膜的性质尚不了解, 特别是在模拟体液与人体真实血液环境中表面膜的性质是否存在有差异尚不确定。在常用的体外模拟体液中, 与PBS、Hanks和Ringer三种配方的溶液相比, r-SBF配方中的离子浓度与人体血液完全一致, 被认为能够准确地模拟血液中的无机成分^[26]。本文将研究Nb-60Ta-2Zr合金在r-SBF和人体真实血液中浸泡后表面氧化膜在化学成分和厚度上的差异, 以揭示人体血液中蛋白质和细胞等对材料表面膜性质的影响。

1 实验方法

1.1 样品的制备

实验用起始材料: 纯度高于99.95%(质量分数)的板条状纯金属铌、钽和锆。经电子束熔炼制备出名义成分为Nb-60Ta-2Zr(质量分数)的合金锭, 并进行锻造和退火处理^[24]。

将锻造退火态的Nb-60Ta-2Zr合金加工成尺寸为10 mm×10 mm×2 mm的试片, 将表面用碳化硅砂纸机械研磨至1200#, 在无水乙醇和去离子水中分别超声清洗5 min, 再用冷风吹干。用于后续的浸泡试验。

1.2 在模拟人体血浆溶液中浸泡

选择r-SBF(revised simulated body fluid)化学配方作为体外模拟血浆溶液^[27], 其成分列于表1。配制r-SBF溶液的二次去离子水的电阻率为18.25 MΩ cm, 按照溶解时的添加次序排列。其中HEPES指的是羟乙基哌嗪乙硫磺酸(2-(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonic acid), 在配制溶液前溶入100 mL二次去离子水备用。添加约0.8 mL的1.0 mol/L NaOH溶液以调整pH值, 并使用型号为SartoriusPB-10的酸碱计测量溶液的pH值。浸泡实验在水浴加热的恒温箱中进行, 温度为37℃。将Nb-60Ta-2Zr合金试片置于300 mL的r-SBF溶液中, 试片表面须充分暴露于溶液中, 在37℃分别浸泡1 h和24 h后将试片取出, 用去离子水冲洗和冷风吹干。

1.3 在全血中浸泡

选择血常规和凝血4项生物化学指标正常、且在10 d内未服用抗凝剂的健康捐献者, 进行肘前静脉采血, 并按照柠檬酸钠与血液的体积百分数为1:9的比例进行抗凝处理。将合金试片置于培养细胞的24孔板内, 每孔加入1 mL体积的PBS, 在37℃孵育1 h。再移除原孔中的PBS溶液, 在每孔中重新加入0.5 mL新鲜抗凝全血, 将孔板置于37℃的恒温箱中分别孵育1 h和24 h。吸出孔板中的血样后, 重新注入PBS溶液, 反复冲洗合金试片表面3次。最后, 将在空气中自然干燥后的试样用于表面分析。

用于扫描电子显微镜(SEM)观察的试样经固定处理。将试样从漂洗后的孔板中依次取出, 置于干净的培养皿内, 用含2.5%(体积百分数)戊二醛的PBS溶液浸泡12 h; 然后再将试片依次置于浓度为50%、75%、90%、100%的无水乙醇溶液中浸泡15 min逐级脱水; 最后, 依次用浓度为50%、75%、90%、100%的乙酸异戊酯无水乙醇溶液逐级脱醇, 每次脱醇时间为15 min。将试样在临界点干燥后取出, 进行真空镀金, 镀层厚度约15 nm。SEM观察在Quanta 600型扫描电子显微镜上完成。

1.4 X射线光电子能谱(XPS)

XPS分析在配有氩离子溅射装置的ESCALAB250表面分析系统上进行。采用单色、能量为1486.6 eV的Al Kα X-射线源, 电子枪的功率为150 W, 电压为15 kV, 电流为10 mA, 束斑尺寸为500 μm×500 μm。用C 1s峰的结合能284.8 eV校正测得的各元素结合能。使用XPSPEAK4.1分析软件, 用Shirley法去除XPS高分辨谱的背底, 再进行分峰拟合, 从而得到高分辨谱上各元素的峰位和积分强度等参数。采用氩离子束溅射的方法确定表面膜的深度, 溅射速度为0.1 nm/s, 溅射面积为2 mm×2 mm、电压3 kV、电流2 μA。采用已知厚度的Ta₂O₃的标准试样校准溅射速度。

2 结果与讨论

2.1 经模拟体液浸泡后合金表面的性质

图1示出Nb-60Ta-2Zr合金经机械抛光后的试样和在r-SBF溶液中分别浸泡1 h和24 h后试样的最外表面层XPS谱。由图1可见, 合金在空气中自然形成的最外表面层上可检测到的元素主要为Nb、Ta、O和C。其中, 结合能位于284.8 eV的C 1s峰主要源于试样表面污染。在r-SBF溶液中浸泡1 h后的试样表面, 除上述几种元素之外, 还可检测到少量P、Ca、Zr和Na元素, 其相对浓度分别列于表2。这些结果表明, 在r-SBF溶液中短时浸泡的合金表面虽然吸附了少量P、Ca和Na元素, 但这些元素并未溶入合金表面层, 表面层的主要组成元素仍然为Nb、Ta和O。即在空气中自发钝化和在溶液中短时浸泡的情况下, Nb-60Ta-2Zr合金表面层的主要由Ta₂O₅和Nb₂O₅构成。

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图1   Nb-60Ta-2Zr合金在空气中机械抛光和在r-SBF溶液中37℃分别浸泡1 h和24 h后表面的XPS全谱

Fig.1   XPS spectrum of the Nb-60Ta-2Zr alloy as-polished and immersed in r-SBF solution for 1 h and 24 h at 37℃

将合金在r-SBF溶液中浸泡的时间延长至24 h后, 合金表面膜的化学成分发生明显变化。由图1可见, Nb和Ta峰的强度大大降低, 而P和Ca峰的强度显著增强。此时合金表面的组成元素为O、Ca、P和C, 以及少量Na、Nb、Ta和Zr元素, 其相对浓度也列于表2。这说明, 在r-SBF溶液中较长时间浸泡后溶液中的Ca和P等元素会沉积于合金表面, 形成由O、Ca和P等构成的最外表面层。

图2a-c示出Nb-60Ta-2Zr合金在37℃下r-SBF溶液中浸泡24 h后试样最外表面层主要元素的高分辨XPS谱, 依次为O 1s、Ca 2p和P 2p。如图2a所示, O 1s峰由O²、OH^-和H₂O三部分构成, 结合能分别位于530.0 eV, 531.2 eV和532.9 eV。其中OH^-和O²峰的强度最强, 表明合金表面的氧元素主要以氢氧化物和氧化物的形式存在, 而H₂O的峰则对应于试样表面吸附的水分子等污染物。在图2b中, 结合能位于347.3 eV和351.0 eV处的峰分别对应于Ca 2p^3/2峰和Ca 2p^1/2峰, 而图2c中结合能位于133.3 eV和130.8 eV处的两个峰均对应于P 2p峰, 说明合金表面主要为Ca、P和O元素组成的化合物。

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图2   Nb-60Ta-2Zr合金在37℃下r-SBF溶液中浸泡24 h后表面层元素(a) O, (b) Ca和(c) P的高分辨率XPS谱

Fig.2   High-resolution XPS spectra of elements (a) oxygen, (b) calcium and (c) phosphorus for the Nb-60Ta-2Zr alloy immersed in r-SBF solution for 24 h at 37℃

结合对表层的逐步氩离子溅射, 确定出在r-SBF溶液中浸泡1 h和24 h后合金试样表面层的元素浓度随深度变化的分布图, 如图3a和b所示。在图3a中, 随着溅射深度延伸至10 nm, O含量从~40 at.%下降至~10 at.%以下, 表明外表面的氧化层已被逐渐剥离。在此同时, Nb、Ta和Zr的含量逐渐增加, 最终趋近于合金的名义成分。在图3b中, 当溅射深度小于50 nm时, 在表面层所检测到的元素主要为O、Ca和P, 而几乎没有金属元素。在溅射深度约20-40 nm范围内, 这三种元素的最高浓度可分别达到56.4%O、26.2%Ca和15.7%P。当溅射深度超过50 nm后, 合金主元素Nb和Ta的含量逐渐升高, O、Ca和P的含量显著降低。如果将氧含量降低至最大值的50%处所对应的溅射深度定义为表面氧化膜的厚度, 则在溶液中浸泡1 h和24 h后合金表面的氧化膜厚度分别为2.3 nm和110 nm, 说明随着浸泡时间的延长试样表面层的增厚非常明显。由此可见, 在r-SBF溶液中长时间浸泡的试样, 由最外表面向内约50 nm范围内均为Ca、P和O化合物的沉积层, 超过50 nm纵深后, 则形成了由Ca、P和O化合物、Ta₂O₅和Nb₂O₅组成的混合物。

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图3   在r-SBF溶液中浸泡后Nb-60Ta-2Zr合金表面层内沿深度的元素含量分布图, (a) 1 h和(b) 24 h

Fig.3   Depth profiles of elemental concentration in the surface of Nb-60Ta-2Zr alloy immersed in r-SBF for (a) 1 h and (b) 24 h

2.2 经全血浸泡后合金表面膜的性质

图4a-c示出一组Nb-60Ta-2Zr合金在37℃下柠檬酸钠抗凝全血中孵育1 h后材料表面的SEM照片(二次电子像模式)。由图4a可见, 在材料的表面上粘附有大量红细胞和少量血小板。大多数粘附的红细胞细胞膜完整, 呈典型的双凹圆盘状, 大小约为8 μm, 见图4b。粘附的血小板呈分枝状, 处于活化状态^[28], 体积明显小于红细胞, 大约在4 μm左右, 见图4c。

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图4   Nb-60Ta-2Zr合金在37℃下全血中孵育1 h后材料表面的SEM照片: (a) 低倍观察下的血细胞分布, 高倍下观察到的(b)红细胞和(c)血小板。图(a)中的白色箭头所指为红细胞, 黑色箭头所指为血小板

Fig.4   SEM images of the surface of Nb-60Ta-2Zr alloy incubated in whole blood for 1 h: (a) adheredblood cells, (b) typical red blood cells, (c) typical platelets. Arrows in (a) point the red blood cells (white) and platelets (black)

为了进一步比较材料在与模拟血浆溶液和人体真实血液之间交互作用上的差异, 揭示与人体血液相接触后合金表面氧化膜的化学性质与厚度变化, 将Nb-60Ta-2Zr合金试样经机械研磨抛光后在37℃全血中分别浸泡1 h和24 h, 然后进行XPS分析。图5给出了经全血浸泡后合金最外表面层的XPS全谱。如图5所示, 全血浸泡1 h后合金表面层可检测到的元素主要为C、O、N和S, 其原子百分数分别为67.7%C, 16.8%O, 14.0%N和0.5%S。此外, 还检测到少量的Cl、P和Ca元素, 浓度也列于表2。随着将浸泡时间延长至24 h, 合金表面层元素C、O、Cl、Ca、S和P的含量变化并不明显。但是N的含量明显降低, 从14.0%下降至4.4%。此外, 在最外表面层还检测到0.8%Nb, 0.9%Ta, 0.4%Na和0.2%Zr。

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图5   Nb-60Ta-2Zr合金在37℃下人体全血中浸泡1 h和24 h后表面的XPS全谱。

Fig.5   XPS spectrum of the Nb-60Ta-2Zr alloy after immersion for 1 h and 24 h in human whole blood at 37℃

将在r-SBF溶液(图1)和全血(图5)中浸泡试样的XPS谱相比较后发现, 在全血浸泡试样的表面可检测到高浓度的C、O、N和S, 其中的N和S均为蛋白质的主要组成成分, 表明在试样表面存在着由有机物构成的吸附层。而且当浸泡时间从1 h延长至24 h后, 在r-SBF溶液中浸泡后试样表面的Ca和P含量均呈现明显的增加, Ca从0.8%增至8.6%, 而P则从1.2%增至7.2%, 分别升高10倍和5倍。但在相同的浸泡时间下, 在全血中浸泡后试样表面的Ca和P增加幅度较小, Ca从0.2%增至1.3%, P则从0.2%增至0.9%。由此可见, 在人体血液中长时间浸泡后, Nb-60Ta-2Zr合金表面主要为有机物的吸附层以及少量的Ca和P等元素, Ca和P的浓度约为1%, 远低于r-SBF模拟血浆溶液中8%的水平。

图6a-d示出经37℃温度下全血中浸泡1 h后Nb-60Ta-2Zr合金最外表面层主要组成元素的高分辨率XPS谱, 依次为O 1s、N 1s、C 1s和S 2p。如图6a所示, 拟合后的O 1s高分辨谱由O², OH^-和H₂O三部分组成, 其结合能分别位于530.6 eV, 531.6 eV和532.8 eV。其中OH^-的峰强最大, 说明O元素主要是以氢氧化物或氨基化合物的形式存在。图6b为N 1s的高分辨谱, 其结合能位于400.0 eV, 对应氨基酸或氨基化合物的官能团。在图6c中, 通过对C 1s峰的分峰拟合处理, 证实其主要由C-H、C-O或C-N、N-C=O三个峰组成, 其结合能分别位于284.8 eV, 286.2 eV和288.0 eV处。其中处于低结合能位置的C-H峰源于试样的表面污染, 因为试样在制备过程中难免吸附有空气中的碳氢化合物。而处于高结合能位置的C-O, C-N和 N-C=O均为蛋白质分子特征官能团的谱峰^{[29, 30]}, 其中C-O峰对应羟基官能团, C-N峰对应胺官能团, N–C=O对应氨基化合物官能团。这些峰的出现表明, 经全血浸泡后的合金试样表面存在由血液中蛋白质分子(如白蛋白、纤维蛋白原、免疫球蛋白等)构成的吸附层。图6d为S 2p的高分辨谱, 其结合能位于163.6 eV, S也是蛋白质核心元素之一。综合试样表面的SEM观察结果和主要元素O、N、C和S的XPS高分辨谱可以证实, Nb-60Ta-2Zr合金与血液相接触后表面自发地吸附有血液中的蛋白质分子和黏附血细胞, 形成了由有机物构成的吸附层。同时, 该吸附层与表面的结合紧密, 不会因为PBS溶液和去离子水的冲洗而发生脱落。

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图6   Nb-60Ta-2Zr合金在37℃下全血浸泡1 h后最外表面层元素的高分辨XPS谱: (a) O 1s, (b) N 1s, (c) C 1s, (d) S 2p。

Fig.6   High-resolution XPS spectra of the outermost layer on Nb-60Ta-2Zr alloy after immersion in whole blood at 37℃ for 1 h. (a) O 1s, (b) N 1s, (c) C 1s, (d) S 2p

经氩离子溅射并结合XPS分析, 确定出在全血中浸泡1 h和24 h后合金表面层的元素含量随其深度变化, 如图7a和b所示。两种情况下试样表面层的主要元素均为Nb、Ta、Zr、O、Ca等, 但其含量因浸泡时间不同略有差异。值得注意的是, 经历全血浸泡后的试样在经过最初10-20 s溅射后, 表面层的Ca元素浓度突然增加。浸泡1 h的试样, Ca浓度由0.2%升高至2.0%; 而浸泡24 h的试样, Ca浓度则由1.3%升高至5.9%, 分别增加了9倍和4倍。继续延深溅射深度, 则Ca的浓度降低。这说明, 在距离最外表层1-2 nm深度部分存在着Ca元素的富集层。随着溅射深度逐渐延深至80 nm, 表面氧化层几乎完全去除, O含量衰减至5%以下, Nb和Ta的含量逐渐升高, 基本上接近于合金的名义成分(Nb-43.5Ta-2.9Zr, at%)。在全血中浸泡1 h和24 h后, Nb-60Ta-2Zr合金表面氧化膜的厚度分别为16 nm和24 nm。由此可见, 随着在全血中的浸泡时间从1 h延长至24 h, 表面层的增厚大约50%。需要强调的是, 与在模拟血浆溶液中浸泡的情况比较, 在全血浸泡后合金的表面氧化膜的厚度变化明显不同。在r-SBF溶液中, 浸泡时间从1 h延长至24 h则氧化膜厚度从2.3 nm增加至110 nm, 差不多增厚了约50倍(见表2), 远远大于在全血中浸泡后表面膜的厚度。

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图7   Nb-60Ta-2Zr合金表面层内沿深度的元素浓度分布图, 在全血中浸泡 (a) 1 h, (b) 24 h

Fig.7   Depth profiles of elemental concentration in the surface of Nb-60Ta-2Zr alloy immersed in whole blood for (a) 1 h and (b) 24 h

显然, 在r-SBF模拟血浆溶液中浸泡后Nb-60Ta-2Zr合金表面氧化膜的化学成分与厚度均与在真实人体血液中浸泡后的情况有明显差异。一方面, 合金在r-SBF中浸泡24 h后, 最外表面层的Ca和P元素浓度达到~8%, 大约是在全血中浸泡后试样的浓度的8倍。由此可见, 与模拟血浆溶液中的情况不同, 在全血中随着浸泡时间的延长, 合金最外表面吸附的Ca和P浓度基本上稳定在1%; 另一方面, 由图3b可见, 合金在r-SBF中较长时间浸泡后在材料外表面沉积形成约50 nm厚的Ca、P和O富集层。在距离外表面下70-110 nm深处检测到较高浓度的Nb、Ta、O、Ca和P 等元素, 是由Ta₂O₅、Nb₂O₅以及Ca、P和O化合物组成的混合物。而在人体真实血液中较长时间浸泡后的结果显示, 合金的外表面没有富集Ca和P的沉积层形成, 其氧化膜的厚度仅为24 nm, 主要由Ta₂O₅和Nb₂O₅构成。

值得指出的是, r-SBF模拟血浆溶液在化学成分上与人体真实血液仍然有很大不同。人体血液的化学成分不仅有Na、K和Ca等阳离子以及Cl^-和HCO₃^-等阴离子, 还含有蛋白质和氨基酸等有机化合物以及红细胞、血小板等血细胞。金属与血液相接触后这些蛋白质分子和血细胞便会吸附于材料表面, 这一有机物的吸附层改变了材料的表面状态, 进而会影响到金属的腐蚀行为、金属离子释放和生物相容性^{[1, 2, 4, 31, 32]}。

3 结论

1. Nb-60Ta-2Zr合金在r-SBF溶液模拟的人体血液环境中短时浸泡后， 表面上形成厚度约2.3 nm、主要由Nb₂O₅和Ta₂O₅构成的钝化膜, 但在全血中短时孵育的合金, 表面层的厚度约16 nm, 含有由C、O、N和S等元素组成的有机物。

2. 在r-SBF溶液中浸泡24 h后, 在Nb-60Ta-2Zr合金表面形成约50 nm厚的Ca、P沉积层, 覆盖于Nb、Ta的氧化膜之上。而在全血中浸泡后的合金表面未出现Ca、P富集层, 只形成厚度约24 nm、主要由Ta₂O₅和Nb₂O₅构成的氧化膜。

3. 在两种介质浸泡后合金表面氧化膜的明显差异显示, 在含蛋白质和血细胞等有机物的全血中, Ca、P等元素向表面的富集受到抑制。r-SBF溶液模拟人体血液环境的仿真能力仍然有局限性, 有待于进一步改进。