胡承波
重庆文理学院 环境材料与修复技术重庆市重点实验室 重庆 402160
HU Chengbo
中图分类号: TQ31, O63, TB324
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收稿日期: 2013-08-25
修回日期: 2013-12-15
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摘要
以双(烷氧-亚胺芳氧)基钛(IV)配合物(BAIP-Ti(IV))为催化剂催化D, L-丙交酯开环聚合合成的Ti-P聚乳酸, 用静态水接触角、吸水率及降解实验考察其理化性能, 以小鼠颅顶前骨细胞(MC3T3-E1)考察其在材料表面的增值和黏附铺展情况。结果表明: Ti-P聚乳酸比Sn-P聚乳酸有较低的亲水性和较高的抗水解性; MC3T3-E1细胞在Ti-P聚乳酸材料表面显示出的较好的增值活力以及细胞黏附与铺展能力; 在Ti-P聚乳酸中残存的微量Ti(IV)金属配合物对MC3T3-E1细胞无细胞毒性, 不影响MC3T3-E1细胞在其材料表面上生长。
关键词：
Abstract
Ti-P polylactide was synthesized by ring-opening polymerization (ROP) of D, L-lactide with bis-(alkoxy-imine-phenoxy) titanium (IV) complex as catalyst. The physico-chemical properties of the Ti-P material were investigated by measurements of contact angle, water absorption rate and degradability, while its biocompatibility to MC3T3-E1 cells, such as the proliferation, adhesion and spreading performance of murine preosteoblastic cells (MC3T3-E1) was also investigated. The results show that the hydrophilicity of Ti-P polylactide is weaker than Sn-P polylactide, inversely, its anti-hydrolysis ability is stronger. In contact with the Ti-P polylactide material, the MC3T3-E1 cells showed excellent activity in proliferation, adhesion and spreading. The rudimental Ti(IV) complex in the Ti-P polylactide exihibits non-toxicity to MC3T3-E1 cell and does not hamper the growth of MC3T3-E1 cells on the surface of the Ti-P polylactide material.
Keywords：
聚乳酸(Polylactide, PLA)具有良好的生物相容性和优良的力学性能, 在食品包装、外科手术缝合线、药物缓控系统以及骨组织工程支架材料等方面得到了广泛的应用[1]。丙交酯(Lactide, LA)的开环聚合是合成结构可控、高分子量聚乳酸的有效方法, 其中低毒的辛酸亚锡(Sn(Oct)2)是用于催化丙交酯开环聚合最为常用的催化剂。但合成的聚乳酸分散指数(Polydispersity Index, PDI)较高(一般大于1.5或更高)[2], 可控性聚合较差, 使聚乳酸材料的规整度以及力学性能降低。
近年来, 探寻对丙交酯的可控开环聚合, 尤其是金属配合物的“配位-插入机理” 催化丙交酯开环聚合是研究的热点[3]。各种具有不同大体积配基的金属配合物, 如含有亚胺芳氧基[4]、芳氧基氨[5]、Salen-双芳氧基 [6]以及half-Salen芳氧基 [7]的配合物对丙交酯的开环聚合显示出可控聚合的特征。这些配合物的配基在丙交酯的开环聚合过程中占据着绝大多数的空间位置而阻止聚乳酸分子内或分子间的酯交换等副反应[8], 最终得到可控的不同微观结构以及低分散度的聚乳酸[9]。一种双(烷氧-亚胺芳氧)基钛(IV)配合物(BAIP- Ti(IV))催化D, L-丙交酯开环聚合合成Ti-P聚乳酸的动力学、机理[10-12]以及对材料微观结构的分析, 已有相关的文献报道[13]。
不同类型的催化剂不仅影响合成聚乳酸材料的微观结构[14], 也影响其理化性能。同时, 在合成的聚乳酸材料中不可避免地残留微量的金属催化剂, 这些残留的催化剂影响其在生物医药领域的应用。合成聚乳酸材料的催化剂种类繁多, 一般采用细胞培养对其生物相容性作初步的评价。本文以BAIP-Ti(IV)配合物催化D, L-丙交酯开环聚合合成Ti-P聚乳酸, 并以辛酸亚锡(Sn(Oct)2)合成的分子量接近、分散度不同的Sn-P聚乳酸作对比, 研究Ti-P聚乳酸的亲水性、降解性以及细胞毒性。
将D, L-丙交酯分别与BAIP-Ti(IV)配合物、辛酸亚锡按照一定的摩尔比例在160℃熔融聚合, 纯化干燥后分别得到Ti-P聚合物(Mn=8.8 × 104g/mol, PDI=1.17) 和Sn-P聚合物(Mn=8.9 × 104g/mol, PDI=1.56)。再分别将Ti-P和Sn-P材料配成浓度为25 mg/ml的二氯甲烷溶液, 磁力搅拌过夜后用0.22 μm尼龙微孔过滤器过滤, 铺在圆形盖玻片上, 自然挥发干和真空干燥后待用。
用液滴法测定聚乳酸材料的静态水接触角。在25℃下将Ti-P和Sn-P两种材料分别固定在接触角测定仪(CQJ-93型)的载玻台上, 用微量注射器将蒸馏水滴加到薄膜材料表面上, 在静态水接触角测定仪的显微镜下读数并拍照, 每个样品在不同的位置测定6次计算其平均值, 要求相对平均偏差小于5.0％。
将约0.3 g(W0)的干燥Ti-P和Sn-P薄膜材料分别置于37℃的蒸馏水中浸泡24 h, 然后取出薄膜材料, 用滤纸吸干表面的游离水(W1), 根据公式1计算吸水率。样品平行测试6次, 计算平均值, 相对平均偏差不得高于1.0％。
分别将用Ti-P和Sn-P两种材料制成的圆形薄膜样品(直径约3 cm)放入直径为3 cm的玻璃培养皿中, 加入3 mL的蒸馏水(pH=6.67), 并用封口膜密封, 置于37±0.5℃的恒温培养箱(WGP-300型)中降解, 每组材料平行做六个样。每隔一周取出每组样品, 用酸度计(pHS-25型, 梅特勒)测量降解介质的pH值, 并计算平均值。盖封, 放入恒温培养箱中继续降解, 连续检测14周, 得出降解介质pH值随降解时间的变化规律。整个实验过程在无菌条件下操作。
将Ti-P和Sn-P干燥至恒重的薄膜材料(精密称重为M0)分别放入pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中, 于37±0.5℃的恒温培养箱(WGP-300型)中恒温降解, 每组材料平行做六个样。每隔一周取出每组样品, 用滤纸吸干表面的游离水, 真空干燥至恒重(M1), 根据公式2计算失重率。
1.5.1 细胞的培养 将小鼠颅顶前骨细胞(MC3T3-E1, 分析纯)用α-MEM培养液(分析纯)、优等胎牛血清(分析纯, 100 ml/L)以及谷氨酰胺(0.35 g/L)培养液, 在37℃的三气培养箱(BB6220型)中培养, 间隔2 d换液。当MC3T3-E1细胞长满大约80%的培养瓶时弃掉培养液并用PBS液清洗1次, 再用0.25％的胰蛋白酶(分析纯)消化到MC3T3-E1细胞收缩变圆, 再加入适量的α-MEM完全培养液, 反复吹打细胞, 使其成为单细胞的悬液, 并以1∶3比例继续传代培养细胞。
1.5.2 测定细胞在材料表面上的增殖活力 将Ti-P和Sn-P材料薄膜置于24孔板中, 在紫外灯下灭菌30 min后, 将调节好浓度为1×108个/L的 MC3T3-E1细胞悬液接种到Ti-P和Sn-P膜材上并于三气培养箱(BB6220型)中培养。分别在接种后第1、3、5、7、9、11 d, 用四唑盐比色法(MTT法)在酶标仪上(Model 550)检测细胞在材料表面上生长的增殖活力, 检测波长为490 nm, 并作空白实验。对实验所得的数据进行统计分析, 各组数据间采用方差分析进行比较, p值< 0.05时为有统计学意义。
1.5.3 观察细胞在材料上的铺展及细胞骨架 将传代后的MC3T3-E1细胞接种并培养24 h后和48 h后用PBS漂洗3次, 戊二醛(2%)固定20 min, 再用PBS漂洗3次后加入0.2% TritonX-100抽提2 min。在暗室中加入罗丹明-鬼笔环肽(5 U/ml), 4℃孵育过夜。然后加入H33258(5 μg/ml)荧光染色1 min, 95%甘油封片[15]。用激光共聚焦显微镜(LSM 510 META型)观察MC3T3-E1细胞的F-肌动蛋白的分布情况, 并拍照记录。
静态水接触角和吸水率是评价材料亲/疏水性的重要指标。在本实验中, 以Sn-P样品做对比, 考察Ti-P样品的静态水接触角和吸水率, 具体结果见表1和图1。
表1 样品的静态水接触角和24 h的吸水率
Table 1 Static water contact angles and water absorption rate of samples
| Samples | Contact angles (°) | Water absorption rate (%) |
|---|---|---|
| Sn-P | 73.8±0.92 (n=6) | 2.03±0.26 (n=6) |
| Ti-P | 82.2±0.71 (n=6) | 1.45±0.42 (n=6) |
图1 两种材料表面静态水接触角 (A: Sn-P, B: Ti-P)
Fig.1 Static water contact angle of two polylactide materials (A: Sn-P, B: Ti-P)
实验结果表明, Ti-P材料比Sn-P材料的接触角大, 吸水率低, 意味着Ti-P材料比Sn-P材料的亲水性差。虽然Ti-P和Sn-P的数均分子量接近, 但Sn-P的分散度却比Ti-P的分散度高。这表明, 在Sn-P中存在规整度较差或支化的聚乳酸, 使Sn-P表面的-COOH和-OH等活性基团比Ti-P的表面多。当水与富含这些活性基团材料的表面接触时与这些活性基团形成氢键而束缚水分子, 因此吸水率增加, 亲水性提高, 被束缚的水在富含这些活性基团的固体材料表面上的接触角就会降低[16]。因此, 以BAIP-Ti(IV)配合物作为催化剂对D, L-丙交酯开环聚合显示出可控的聚合行为, 使合成的Ti-P材料有着好的规整度以及较低的支化度, 从而降低了Ti-P材料表面-COOH和-OH等活性基团的含量, 使 Ti-P材料的亲水性降低。
与Sn-P聚乳酸对比, Ti-P聚乳酸和Sn-P聚乳酸降解过程中失重率的变化情况如图2所示。
图2 材料降解失重率随时间的变化(n=6)
Fig.2 Change of weight loss with degradation time for material samples (n=6)
由图2可知, Ti-P和Sn-P在降解过程中失重率随时间变化的趋势基本相同, 失重率随着时间的延长按照逐渐增长、快速增长、缓慢增长三个阶段的方式进行。随着时间的延长两种材料的失重率呈相同的增长趋势, 但Sn-P表现出较高的失重率。在逐渐增长区, 失重的部分主要是聚乳酸材料表面小分子的聚合物和单体。但两种聚乳酸材料的失重率从逐渐增长区进入快速增长区的时间有所不同。Sn-P的失重率在第6周就明显增长, 而Ti-P在第7周才开始出现快速的增长。其原因是, Sn-P分散度比Ti-P的分散度高, 支化的Sn-P聚乳酸中存在较多的羧基和羟基, 易于和PBS中的水形成氢键, 加速了水分子对材料表面的侵蚀。同时, 酸的自催化作用也加速了材料的降解。而在缓慢增长阶段, 降解作用逐渐渗透到材料的内部, 进而发生缓慢的降解。这与Ti-P聚乳酸有着良好的规整度以及较低的支化度有关, 使Ti-P的失重率增长速度明显低于Sn-P的失重率增长速度。
以Sn-P聚乳酸做对比, Ti-P聚乳酸和Sn-P聚乳酸降解过程中降解介质pH值的变化情况, 如图3所示。
图3 在材料降解过程中pH值的变化(n=6)
Fig.3 PH change of distilled water with degradation time for material samples (n=6)
由图3可见, Ti-P和Sn-P材料降解过程中降解介质的pH值变化规律基本保持一致。聚乳酸在整个降解过程, 包括水化、初步水解、深度水解和溶解于介质这四个阶段。在水化阶段, 水通过亲水基团或者其他分子间的相互作用力接近聚乳酸材料的表面, 聚乳酸材料的化学结构并没发生变化, 只是表面的小分子和单体溶解于介质中。因此, 介质的pH值变化不大, 如图3中的第1-2周。在初步水解区, 在聚乳酸材料表面的部分水位点开始发生酯的水解反应, 链发生断裂并释放出部分-COOH和-OH, 这时pH值开始缓慢下降, 如图3所示第3-7周。随着水化位点的逐渐增加酯水解的位点也逐渐增加, 蒸馏水介质中H+的浓度逐渐提高, 导致酸致自催化的酯水解速率也继续增大, 同时释放出的更多的-COOH基团。这两种效应共同导致Ti-P和Sn-P材料降解过程中出现pH值陡降现象, 进入了深度水解区。从图3可见, Ti-P和Sn-P降解液pH值的陡降区分别出现在第6周和第7周, 这可能与这两种材料降解时的失重率分别在第6周和第7周进入深度水解区有关。在溶解降解介质的阶段, 溶解的都是一些小分子的化合物或降解的片段, 随着降解的进行缓慢释放出-COOH降解液的pH值出现缓慢下降的趋势(图3中的第11周后)。Ti-P和Sn-P两种材料在降解过程中介质的pH值变化规律基本一致, 也与相关的文献报道相似[17]。但在总体上, Sn-P材料降解时降解介质pH值下降幅度大于Ti-P材料降解时降解介质pH值的下降幅度。这也与材料失重率变化的趋势一致, 也间接地证明了以BAIP-Ti(IV)配合物催化合成的分散度低的Ti-P材料有着更好的抗水解作用, 表明BAIP-Ti(IV)对D, L-丙交酯显示出可控开环聚合的特征。
用MTT法检测MC3T3-E1细胞在各组材料上的增殖活力, 如图4所示。
图4 MTT检测MC3T3-E1细胞在不同材料上的增殖情况(490 nm)
Fig.4 Proliferation of MC3T3-E1 cells by MTT cultured on glass, Sn-P and Ti-P materials (The data are the means ± SD for n=6, **p < 0.05, 490 nm)
从图4可以看出, 随着培养时间的延长MC3T3-E1细胞在不同基底材料表面细胞数量呈增加的趋势。在MC3T3-E1细胞接种后的3 d内, 由于聚合物材料对接种的MC3T3-E1细胞均给了不同程度的刺激(如表面形貌、粗糙度以及化学结构等), 细胞主要处于适应阶段, 因此增殖速度比较慢; 随着培养时间的延长细胞通过自身的调节机制逐渐适应材料表面的外界环境, 开始分裂增殖, MC3T3-E1细胞培养 3 d后在各组材料上的细胞增殖明显, 尤其在3至7 d期间细胞处于对数生长期, 增殖速率更大; 细胞培养7 d后各组材料表面的细胞增殖速率都显著降低, 因为细胞密度过大抑制了细胞增殖外, 一部分的细胞已进入分化期, 开始分泌细胞外基质。图4还表明, 在培养的第1、3、5、7、9和11 d, Sn-P材料组和Ti-P材料组细胞的增殖活力显著性高于空白组细胞(p<0.05), 并且Sn-P材料组和Ti-P材料组之间细胞的增殖活力间不存在显著的差异, 表明MC3T3-E1细胞在以BAIP-Ti(IV)配合物作催化剂合成的Ti-P材料上显示出较好的增殖活力和良好的生物相容性。
MC3T3-E1细胞在不同材料表面骨架的铺展情况, 如图5所示。从图5可见, MC3T3-E1细胞培养24 h后空白组细胞主要呈长梭形, 完全粘附, 铺展面积较大, 而细胞骨架肌动蛋白纤维清晰可见, 且已充分伸展(图5中的A1图)。Sn-P和Ti-P材料组的细胞呈星形或不规则的形状, 也完全铺展并且铺展面积也较大。细胞骨架肌动蛋白纤维已经完全铺展, 且大于空白组的铺展面积。这表明, Sn-P和Ti-P材料组细胞的形态和细胞骨架的分布(图5的B1图和C1图)比空白组有显著的变化。MC3T3-E1细胞培养48 h后各组材料上的细胞伸出的突起与邻近的细胞紧密相连, 显示出较好的细胞黏附与铺展能力。Ti-P材料和Sn-P对MC3T3-E1细胞显示出较好的生物相容性(图5中的A2、B2、C2图), 表明以BAIP-Ti(IV)配合物作催化剂合成的Ti-P聚乳酸与辛酸亚锡作催化剂合成的Sn-P聚乳酸相同, 不影响MC3T3-E1细胞在其材料表面上的生长, Ti-P聚乳酸材料同样对MC3T3-E1细胞显示出良好的生物相容性。其原因是, BAIP-Ti(IV)配合物做催化剂时, 合成的Ti-P聚乳酸是以O-Ti键封羟基端的聚合物[11]。该O-Ti键在以四氢呋喃/水体系提纯时, O-Ti键在水的作用下易于断键而最终生成端羟基的聚乳酸, 从而消除Ti-P聚乳酸上残存的BAIP-Ti(IV)配合物, 进而减少了金属配合物对细胞毒性的危害, 残留的Ti(IV)配合物催化剂不影响细胞在材料表面的生长。
图5 培养不同时间的MC3T3-E1细胞在Glass(A)、Sn-P(B)以及Ti-P(C)表面的激光共聚焦成像 (A1, B1, C1)24 h; (A2, B2, C2)48h
Fig.5 Images of MC3T3-E1 cells on different materials after 24 h and 48 h of culture visualized by laser confocal microscope, images show cell nucleus (blue) and actin cytoskeleton (red) of cells
生物医用高分子材料的理化性能与其分子结构有关。BAIP-Ti(IV)配合物催化D, L-丙交酯开环聚合合成的Ti-P聚乳酸, 有比Sn(Oct)2合成的Sn-P聚乳酸较低的亲水性。Ti-P聚乳酸的抗水解降解性高于Sn-P聚乳酸, 但二者有相似的降解规律。MC3T3-E1细胞在Ti-P聚乳酸材料表面显示出较好的增殖活力, 且Ti-P聚乳酸中残存的微量金属配合物对MC3T3-E1细胞没有细胞毒性, 不影响MC3T3-E1细胞在Ti-P聚乳酸材料表面上生长。
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