0 引言

纳米纤维素(cellulose-nanofibers, CNFs)具有高保水值、高结晶度、较好的生物相容性和无毒等特性, 广泛用于生物医药、组织工程等领域^{[1, 2]}。目前纳米纤维素用于组织工程支架制备的研究主要集中在细菌纤维素方面。Andersson等^[3]添加石蜡微球制备出150-300 μm的细菌纤维素多孔支架, 并将人的软骨细胞种植于支架上, 对细胞的行为进行了评估。结果表明: 细菌纤维素支架在整个厚度范围内具有高度联通的孔隙结构; 软骨细胞在体外培养24 h后细胞出现在整个支架的表面, 并逐渐向支架内生长, 支架内细胞的数量随着时间的延长不断增加, 细胞渗入深度达100 μm; 软骨细胞在多孔细菌纤维素支架内增殖生长, Alcian blue van Gieson染色发现软骨细胞在细胞聚集区域产生细胞外基质成分, 且细胞外基质随着细胞数量的增加而增多。虽然细菌纤维素有望作为组织工程支架的材料, 但是天然的细菌纤维素形成的支架不具备适合细胞生长的大孔, 而且需要通过其它方式改善孔结构, 或者与其它材料复合对其增强^[4-7]。由于木质纳米纤维素的来源丰富, 对其在组织工程支架的应用研究受到了越来越多的关注。Bhattacharya等^[8]用植物纳米纤维素水凝胶作为细胞培养的支架, 构建细胞生长的三维环境并诱导HepaRG和HepG2细胞球体的成型。植物纳米纤维素水凝胶具有可逆凝胶化且粘弹性质与细胞外基质类似。纳米纤维素形成凝胶状态后, 可提供细胞生长与分化所需的机械支撑力。结果表明非人与非动物来源的植物纳米纤维素水凝胶具有满足肝细胞培养的多孔结构和力学强度。以桉木浆为原料, 采用TEMPO氧化结合机械均质处理制备的高聚合度的纳米纤维素, 与PVA复合可制备三维组织工程支架^[9]。这种纳米纤维素/PVA复合支架为细胞的生长提供了类似细胞外基质的结构, 并且纳米纤维素为细胞的粘附提供了锚点, 因此细胞生长良好。在结构上, 支架在3个尺度范围内控制组织的生长发育过程^[10-12]: 在大尺度范围(毫米到厘米尺度)内决定工程组织的形状和大小; 支架孔隙的大小和形态结构(微米尺度)调节细胞的生长和迁移; 支架材料的表面化学基团及介质的结构特性(纳米尺度)调节和引导细胞的贴附、铺展以及基因的表达。材料表面的空间拓扑结构, 尤其是材料表面的粗糙程度、孔径的大小及分布等都对细胞的形态、粘附、生长、增殖、铺展、分化等有重要的影响。

目前, 常用粒子致孔法、热诱导相分离法、气体发泡法和烧结微球法等方法控制多孔泡沫或海绵状支架的结构。如Andersson等^[3]、Zaborowska等^[4]均利用石蜡微球来控制细菌纤维素的多孔结构, 以获得一定尺寸的多孔支架。张人佶等^[12]以一定尺寸的NaCl作为致孔剂设计出多级孔隙结构、贯通的大孔结构和高孔隙率的骨、软骨组织工程支架。此外, 理想的组织工程支架不仅要求具有适合的孔径大小, 也需要具备一定的机械强度, 为细胞的生长与分化提供支撑力^{[13, 14]}。用单纯的纳米纤维素制成的支架吸水后形成凝胶状, 具有良好的吸水性与保水性, 与壳聚糖、细菌纤维素、明胶等^[4-7]常用天然材料制备的组织工程支架有着相似的特性。但是, 纯纳米纤维素支架在水中的湿强较低, 形成的凝胶强度差, 易发生崩塌, 内部的多孔结构也会遭到破坏, 达不到组织工程对支架的要求。因此, 需要添加具有增强功能的组分, 赋予纳米纤维素支架一定的湿强度和结构稳定性。PVA具有显著的增强作用, 常与其它材料复合制备一定力学强度和结构稳定性的复合组织工程支架^[15-17]。

本文在文献[9]的基础上采用冷冻干燥的方法制备CNFs/PVA复合支架, 并通过控制CNFs悬浮液浓度、PVA的相对分子质量及CNFs与PVA的质量比、冷冻温度等条件调控支架的多孔结构(包括孔隙率、孔径分布)以及机械性能, 以期制备出具有类似细胞外基质的纳米空间结构、适合组织培养的三维组织工程支架。

1 实验方法

1.1 CNFs/PVA组织工程支架的制备

实验用原料与试剂: 纳米纤维素, 0.3%和0.5% (质量分数)的CNFs悬浮液; 高相对分子质量(质均)PVA, M_w 146000-186000, 99%+醇解度; 低相对分子质量(质均)PVA, M_w 89000-98000, 99%+醇解度。

将一定量的PVA加入到100 g不同浓度的CNFs悬浮液中, 水浴加热使悬浮液温度保持在90℃以上, 并不断搅拌; 待PVA完全溶解后冷却至室温, 将混合溶液超声15 min, 使其混合均匀; 超声后将纤维素/PVA混合溶液加入到24孔细胞培养板中, 置于-20℃、-80℃以及液氮条件下预冻, 并在-50℃下冷冻干燥。三维多孔支架制备工艺条件和试样编号列于表1。

1.2 CNFs/PVA组织工程支架的表征

将支架材料固定到导电胶上, 喷金后用LEO 1530VP场发射扫描电镜(FE-SEM)观察支架材料的形貌和空间结构。

将支架材料裁成直径13 mm、高7 mm的圆柱体, 使用附带2KN传感器的Instron-5565万能材料试验机和配套的Bluehill软件在压缩速率1 mm/min、(23±2)℃和(50±5)%的相对湿度条件下测试支架材料的干态力学性能, 每个样品测定5次。由压缩应力-应变曲线中的第一线性区计算材料的压缩模量, 将第一线性区结束时的压缩强度作为材料的最终压缩强度。

2 结果和讨论

2.1 CNFs/PVA组织工程支架的宏观形态

使用数码相机拍摄的支架材料的宏观形貌和支架吸水后的形貌照片, 如图1所示。在宏观上, 未添加CNFs时支架材料呈无规则的形状(图1a), 添加CNFs后支架材料可以被模具塑造为不同的形状, 本实验模具得到的支架材料为圆柱状(图1c, e)。高相对分子质量PVA吸水后成为水凝胶(图1b), 添加CNFs制备得到的CNFs/PVA支架吸水后也为凝胶状, 具有很好的吸水性和保水性(图1d, f)。

显示原图| 下载原图ZIP| 生成PPT

图1   纳米纤维素与高相对分子质量PVA质量比为0∶1.5、0.5∶0.5、0.5∶1.5的支架材料的数码照片

Fig.1   Digital photos of CNFs/PVA scaffolds with different mass ratio. Figs.a, c and e represent 01580H, 51180H and 51380H respectively, while Figs.b, d and f stand for hydrogel of 01580H, 51180H and 51380H respectively; 01580H, 51108H and 51280H means scaffolds with mass ratios of 0∶1.5, 0.5∶0.5 and 0.5∶1.5 between CNFs and PVA, respectively

为了获取CNFs/PVA支架材料的微观形貌, 探讨CNFs悬浮液浓度、PVA种类及添加量、冷冻温度对支架材料微观形貌和结构的影响, 实验中使用SEM观察了在各种条件下制备的支架材料的微观形貌。

显示原图| 下载原图ZIP| 生成PPT

图2   1.5 g高相对分子质量PVA分别添加到100 g质量分数0%、0.3%和0.5%的CNFs悬浮液中在-80℃冷冻制备的支架的SEM像

Fig.2   SEM images of scaffolds prepared from 100g CNFs suspension in mass percentage of 0% (a, d, g, j), 0.3% (b, e, h, k) and 0.5% (c, f, i, l), respectively, with addition of 1.5 g PVA of high relative molecular mass (mass average) freezing at -80℃

2.2 CNFs悬浮液浓度对支架材料形貌和结构的影响

将PVA添加量保持在1.5 g, 改变CNFs悬浮液的浓度, 使纤维素与PVA的比例分别为0∶1.5、0.3∶1.5、0.5∶1.5, 在-80℃冷冻混合溶液, 研究了CNFs悬浮液浓度对支架形貌和结构的影响, 使用高相对分子质量和低相对分子质量PVA制备的CNFs/PVA支架的微观形貌, 如图2和3所示。

从图2可以看出, 在PVA中加入CNFs对支架形貌和结构有很大的改变, 支架的孔径和孔隙率增加, PVA形成大孔的孔壁, 大孔孔径约为20-150 μm; CNFs束在PVA孔壁的表面形成微丝(图2h, i), 微丝搭接构成小孔和微孔, CNFs束微丝直径在100-200 nm(图2k, l); CNFs/PVA支架材料整体的孔径呈梯度分布, 大孔利于细胞的渗透、迁移和营养物质的输送, 微孔为细胞的生长创造良好的微环境; 孔上下贯通, 利于生理营养物质和气体向细胞的扩散, 以及细胞代谢废物和副产品的移除^[18]。

对比图2j-l可以发现, CNFs加入前后支架的孔壁由单纯PVA的光滑表面变为粗糙的网状结构表面, 利于细胞的贴附和生长^[19]。此外, 微丝搭接的网状结构类似于细胞外基质(ECM)中直径50-500 nm的胶原纤维交叉结合形成的胶原骨架^[20]。ECM是组织中细胞生长的微环境, ECM中存在纳米尺度的孔、纤维和隆起, 细胞表面的受体为纳米级, 细胞表面结构功能域的尺度也是纳米级, 而且生物功能分子、ECM组分和细胞之间的相互作用也是发生在纳米级。这就为使用CNFs结合纤维蛋白、蛋白多糖和各式各样的糖蛋白类物质, 构造细胞生长的微环境, 研究细胞与材料、环境之间的纳米效应以及材料对细胞的定向诱导提供了理论基础。此外, 从图3b, c可以看出, 随着纤维素与PVA的比例由0.3∶1.5提高到0.5∶1.5支架材料中大孔孔径变小, 因为CNFs在大孔中形成了更多的小孔和微孔。

显示原图| 下载原图ZIP| 生成PPT

图3   1.5 g低相对分子质量PVA分别添加到100 g质量分数0%、0.3%和0.5%的CNFs悬浮液中在-80℃冷冻制备的支架的SEM像

Fig.3   SEM images of scaffolds prepared from 100 g CNFs suspension in mass percentage of 0% (a, d, g), 0.3% (b, e, h) and 0.5% (c, f, i), respectively, with addition of 1.5 g PVA of low molecular mass (mass average) freezing at -80℃

在低相对分子质量PVA中添加CNFs 的成孔情形, 与高相对分子质量PVA有所不同。从图3a, d, g可以看出, 低相对分子质量的PVA呈片状; CNFs悬浮液浓度为0.3%(质量分数, 下同)时, 与未添加CNFs的样品相比, 支架材料的孔增多, 但孔的内壁仍然光滑(图3b, e, h), 未出现类似使用高相对分子质量PVA制备的CNFs/PVA支架31580H(图2b, e, h, k)表面的微丝网络结构; 当CNFs悬浮液浓度为0.5%时微丝结构出现, 但微丝仅贴附在孔壁的表面, 没有空间的搭接(图3i, i' ); 此外, 使用浓度0.3%的CNFs悬浮液制备的CNFs/PVA支架31580L(图3b)的孔壁分布类似层状, 这可能与PVA的片状结构有关; 而使用浓度0.5%的CNFs悬浮液制备的CNFs/PVA支架51380L(图3c)的孔壁则呈方格状, 而且孔壁更厚。

通过以上分析并对比图2和3可见, 与低相对分子质量PVA相比, 高相对分子质量PVA与CNFs混合后制备得到的CNFs/PVA支架, 孔表面粗糙、孔径呈梯度分布、大孔内部微丝搭接成为类似ECM的网络结构, 更符合组织工程支架的要求; 改变CNFs悬浮液的浓度, 可以制备得到不同孔径和结构的支架。

2.3 CNFs与PVA的质量比对支架材料形貌和结构的影响

将CNFs悬浮液的浓度保持在0.5%, 使CNFs与PVA的质量比分别为1∶1、1∶2、1∶3, 在-80℃冷冻混合溶液, 研究CNFs与PVA的质量比对支架材料形貌和结构的影响。使用高相对分子质量PVA制备的不同质量比的CNFs/PVA支架材料的SEM像, 如图4所示。从图4a-c可以看出, CNFs与高相对分子质量PVA的质量比对支架材料孔结构和形貌影响很大: 随着CNFs与PVA质量比由1∶1减小到1∶3, 大孔孔径变小, 在质量比为1∶1的样品 (51180H) 中大孔孔径从几十到几百微米, 形成上下连通的通道(图4a, d); 在质量比为1∶2的样品(51280H, 图4 b, e)和质量比为1∶3的样品(51380H, 图4c, f)中大孔相对均一, 直径约为20-150 mm(图4e), 大孔在某一层面上均匀排列分布; 对于孔内部的微丝结构, 样品51280H和51380H内部由CNFs束形成的微丝网状结构比51180H丰富, 且随着PVA添加量的增加大孔孔壁变厚(图4g-i), 但是PVA添加量的变化对微丝直径没有很大的影响。

显示原图| 下载原图ZIP| 生成PPT

图4   将0.5 g、1.0 g和1.5 g高相对分子质量PVA分别添加到100 g 0.5%的CNFs悬浮液中在-80℃冷冻制备的支架的SEM像

Fig.4   SEM images of scaffolds prepared from 100 g 0.5% CNFs suspension with addition of 0.5 g (a, d, g, j), 1.0 g (b, e, h, k) and 1.5 g (c, f, i, l) PVA of high relative molecular mass (mass average), respectively, at -80℃ for freezing

2.4 冷冻温度对支架材料形貌和结构的影响

将纤维素的浓度保持在0.5%, PVA的添加量为1.0 g, 使纤维素与PVA的比例保持为1∶1, 分别在-20℃、-80℃和液氮中冷冻混合溶液, 研究冷冻温度对支架材料形貌和结构的影响, 使用高相对分子质量PVA制备得到的CNFs/PVA支架材料的SEM像, 如图5所示。从图5a-c可以看出, 冷冻温度对使用高相对分子质量PVA制备的CNFs/PVA支架的形貌和结构影响很大。随着冷冻温度的降低, 支架的孔逐渐均一规整, 且大孔孔径变小, PVA的分布变均匀。在不同冷冻温度条件下制备的CNFs/高相对分子质量PVA支架的孔结构不同: 在-20℃冷冻制备的CNFs/PVA支架材料51220H(图5a, d)中, 片状PVA无序地形成孔壁, 大孔分布不规则; 在-80℃冷冻制备的CNFs/PVA支架材料51280H(图5b, e)中, 大孔出现层次, 在某一平面上排列; 在液氮冷冻制备的CNFs/PVA支架材料512NH(图5c, f)中, 孔径分布均匀, 且大孔孔径减小至约20-30 mm。其原因是, 温度的降低促使PVA相与水相均匀分离, 从而使PVA形成均匀的孔壁。除此之外, 由于温度不同, 支架孔壁内部的微丝分布也出现差异: 样品51220H(图5g, j)孔壁上的微丝主要附着在孔壁的表面, 极少搭接形成类似ECM网状结构的微孔; 51280H(图5h, k)孔壁上仍由微丝搭建的微孔网络结构; 512NH(图5i, l)孔壁上未发现微丝, 孔壁上出现空洞。在急速的冷冻过程中, PVA相均匀分散, 将CNFs包裹其中, 在PVA相浓度相对较低的地方出现孔洞。

显示原图| 下载原图ZIP| 生成PPT

图5   1.0 g高相对分子质量PVA添加到100 g 0.5%的CNFs悬浮液中分别在-20℃ (a、d、g、j)、-80℃ (b、e、h、k)和液氮 (c、f、i、l)冷冻制备的支架的SEM像

Fig.5   SEM images of scaffolds prepared from 100 g 0.5% CNFs suspension with addition of 1.0 g PVA of high relative molecular mass (mass average) at -20℃ (a, d, g, j), -80℃ (b, e, h, k) and liquid nitrogen (c, f, i, l), respectively, for freezing

冷冻温度对多孔支架的形态有很大的影响, 随着冷冻温度的降低, 支架中较大孔径的百分比逐渐减小, 而较小孔径的百分比逐渐增大, 支架中的孔结构逐渐变得均一^{[21, 22]}。这些结果与本文实验结果一致。由此可见, 控制冷冻温度可调控支架的内部孔结构, 温度过高或过低都不利于大孔的均匀分布和孔内部微丝结构的形成。本文实验较理想的冷冻温度为-80℃, 此时大孔孔径相对均匀, 微丝搭建的微孔结构也符合要求。

2.5 CNFs/PVA支架材料的力学性能

将0.5 g、1.0 g和1.5 g高相对分子质量PVA分别添加到100 g 0.5%的CNFs悬浮液中, 在-80℃冷冻制备支架。测定支架的压缩模量, 研究PVA的用量对支架力学强度的影响, 结果如图6所示。从图可以看出, 支架的压缩模量随着PVA用量的增多而提高。高相对分子质量PVA的添加量由0.5 g增加至1.0 g和1.5 g, 图6中支架的压缩模量由(101.4±21.8) kPa增加至(239.4±11.7) kPa和(314.6±52.3) kPa。这表明, 支架材料的力学强度主要决定于PVA, 而且PVA对支架材料的压缩模量起调控作用, 可通过改变PVA的添加量来调节支架材料的力学性能。

同时, 本文制备的支架材料的压缩模量与软骨组织的弹性模量^[23]数量级相同, 而支架材料的弹性模量对于干细胞发育及诱导有重要作用。不同弹性模量的支架材料可诱导干细胞发育成为与之弹性模量相一致的组织^[23], 且可通过调节PVA的相对分子质量和用量调节支架材料的力学性能, 使诱导过程顺利进行。

显示原图| 下载原图ZIP| 生成PPT

图6   高相对分子质量PVA/CNFs支架材料的压缩模量与PVA添加量的关系

Fig.6   Variation of compressive modulus for high molecular PVA/CNFs scaffolds as a function of the addition of PVA, the scaffolds were prepared from 100 g CNFs suspension (0.5 %) with addition of 0.5 g, 1.0 g and 1.5 g PVA of high relative molecular mass (mass average), respectively, freezing at -80℃

3 结论

1. 用冷冻干燥法制备的纳米纤维素(CNFs)/PVA支架材料吸水后形成凝胶, 具有较好的吸水性和保水性。

2. CNFs/高相对分子质量PVA支架具有梯度分布、内部连通的孔结构, PVA形成大孔的孔壁, 直径100-200 nm的CNFs束在孔壁上桥接为类似于细胞外基质(ECM)中胶原骨架的网状结构; CNFs浓度为0.5%、与PVA的质量比为1∶2、冷冻温度为-80℃时, 支架内部的微丝丰富且网络结构较好。

3. CNFs/PVA支架材料的力学强度主要取决于PVA, 改变PVA的添加量可调节支架材料的力学性能。