贝壳珍珠质及交叉叠片结构体外类骨磷灰石生长的对比研究

图1 扇贝的宏观形貌、腐蚀后横截面的微观结构以及褶纹冠蚌的宏观形貌、横截面自然断口形貌、贝壳平面内的腐蚀形貌、矿物板片腐蚀后的微观形貌

Fig.1 Overall views and microstructures of the Pectinidae (a~d) and Plicata (e~h) shells

1.2 观察样品的自然断口和腐蚀后的形貌

先用水冷低速金刚石切割机制备贝壳的块状材料，然后掰断以产生自然断口。依次用600#、1200#和2000#的砂纸将用于腐蚀的样品仔细研磨，用0.5#金刚石研磨膏机械抛光后将其在0.1 mol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液中腐蚀1 min。用无水乙醇充分清洗自然断口和腐蚀样品，在Ultra Plus冷场发射电子显微镜(SEM)下观察其形貌。

1.3 生物活性样品的制备

用金刚石线切割机将原贝壳切成尺寸为0.8 cm×2 cm、厚度为0.7 mm的块状样品，依次用粗细金相砂纸将表面细磨至光滑。将样品进行超声清洗后，放入烘箱中干燥1 h。

1.4 贝壳体外生物活性的测试

用磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)和磷酸(H₃PO₄)分别配制0.2 mol/L Na₂HPO₄和5 g/L H₃PO₄溶液。将Na₂HPO₄溶液滴定到H₃PO₄溶液中得到pH值为7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)。用磷酸缓冲溶液浸泡法对两种贝壳的片层进行预处理，然后将其置于37℃的人体模拟体液(142.0 mmol/L Na⁺，5.0 mmol/L K⁺，1.5 mmol/L Mg²⁺，2.5 mmol/L Ca²⁺，148.8 mmol/L Cl^-，4.2 mmol/L HCO $_{2}^{- 3}$ ，1.0 mmol/L HPO $_{2}^{- 4}$ ，and 0.5 mmol/L SO $_{2}^{- 4}$ )(SBF)^[18]中，对比两种微观结构对磷灰石在贝壳表面的沉积及其生物活性的影响。实验分为两个阶段：

第一阶段(PBS浸泡)：将每种贝壳的6个生物活性样品分成三组，第一、二组有1个扇贝样品和1个褶纹冠蚌贝壳样品，第三组有4个扇贝样品和4个褶纹冠蚌贝壳样品。将三组样品都放入12个盛有PBS溶液的塑料瓶中浸泡，第一组浸泡1 d，第二组浸泡3 d，第三组浸泡5 d。将标记的塑料瓶放入37℃的恒温振荡器中。达到浸泡时间后，将样品依次用蒸馏水、无水乙醇清洗后置于烘箱干燥皿中干燥，并标记贝壳的种类和浸泡时间。

第二阶段(SBF浸泡)：从第一阶段浸泡时间为5 d的第三组样品中取3个扇贝样品和3个褶纹冠蚌贝壳样品，再将这6个样品分成三组，每组各有1个扇贝样品和1个褶纹冠蚌贝壳样品。将三组样品放入6个盛有SBF溶液的塑料瓶中浸泡，浸泡时间分别为5、10和15 d。在小塑料瓶上标记样品的种类和浸泡天数后放入37℃的恒温震荡器。达到浸泡时间后，重复阶段一中对样品的后续处理。

1.5 样品的表征

用D/MAX-RB型X射线衍射仪(XRD)分析样品的物相：Cu-K辐射(λ=0.15406 nm)，加速电压40 kV，电流50 mA，扫描速率10 (°)/min，扫描范围为θ=20°~80°。用型号为4300 DV(ICP-AES)的电感耦合等离子体原子发射光谱检测浸泡后PBS溶液中离子浓度的变化，用PHS-3E电极检测PBS溶液pH值的变化。

2 实验结果

2.1 扇贝和褶纹冠蚌的微观结构

图1b~d给出了扇贝横截面中间部位的显微结构。可以看出，这个部位的形貌类似于“山峦”(图1b)，为典型的交叉叠片结构。这种结构的厚度约占壳体厚度的3/4。图1c给出了“山峦”形貌的放大图，可见不同部位之间结构基元的排布方向发生了旋转。进一步放大可见，该结构基元为宽度约为1 μm的板条。

图1f~h给出了褶纹冠蚌横截面的显微结构。可以看出，这种贝壳具有典型的“砖墙”形貌，即珍珠质结构。构成这种结构的文石板片的厚度约为1 μm (图1f)，板片的上表面具有不规则的多边形形貌(图1g)。将文石板片放大后，可见其由大量的纳米颗粒堆叠而成。两种贝壳片层的表面形貌表明，其结构有较大的差异。

2.2 贝壳浸泡在PBS中磷灰石在其表面的生长

图2给出了两种贝壳的原始样品及其在PBS浸泡不同时间后的XRD谱。由图2可见，扇贝中的无机相是方解石型碳酸钙，而褶纹冠蚌的无机相是文石型碳酸钙。图2a给出了扇贝样品浸泡在磷酸缓冲(PBS)液中前后的XRD谱。可以看出，在PBS液中浸泡1 d后磷灰石的特征峰强度较弱，浸泡3 d后磷灰石特征峰逐渐增强，表明更多的扇贝表层转化成磷灰石；浸泡5 d后出现了新的磷灰石特征峰(2θ=32.9°)，说明表层磷灰石的含量逐渐提高。图2b给出了褶纹冠蚌样品在PBS溶液中浸泡前后的XRD谱。可以看出，浸泡1 d后谱中出现了磷灰石的特征峰，说明样品表层有磷灰石生成，但是峰强远小于褶纹冠蚌原始相对应峰的峰强；浸泡3 d和5 d后磷灰石的特征峰的强度提高，但是没有出现新的特征峰，表明磷灰石的转化效率较低，也表明生成的磷灰石结晶度较低^[19]。

图2

图2 扇贝和褶纹冠蚌贝壳样品浸泡PBS前后的XRD谱

Fig.2 XRD patterns of the Pectinidae (a) and Plicata (b) shell samples before and after soaking in PBS

图3给出了两种贝壳样品在PBS液中浸泡不同时间后表面的SEM形貌，可见浸泡不同程度地改变了两种贝壳表面的原始微观形貌。浸泡1d后两种贝壳的表层均出现了少量片状物质(图3a, d)，由XRD的分析可知新物质为磷灰石。浸泡3 d后在扇贝表层已出现了片状磷灰石，且部分聚集形成花椰菜状晶体(图3b)，褶纹冠蚌表层的磷灰石也覆盖了明显的片状物质(图3e)。浸泡5 d后扇贝表层几乎全部覆盖了磷灰石相，且有更多的花椰菜状的磷灰石晶体形成(图3c)，而褶纹冠蚌表层的磷灰石虽然数量增加但是覆盖厚度不均(图3f)，且没有生成花椰菜状的磷灰石晶体。

图3

图3 扇贝和褶纹冠蚌贝壳样品浸泡在PBS后的SEM照片

Fig. 3 SEM images showing the surface morphologies of Pectinidae (a~c) and Plicata (d~f) shell samplessoaked in PBS for 1, 3 and 5 days, respectively

与褶纹冠蚌相比，在相同的条件下，在具有交叉叠片结构的扇贝上生成的磷灰石数量较多且比较致密。

图4给出了两种贝壳样品的X射线能谱(EDS)，分析了样品微区的元素含量和表面生成物的Ca/P比。可以看出，在PBS中浸泡后贝壳表面发生了溶解反应而游离出钙离子。溶液中的离子浓度达到过饱和时，钙离子与溶液中的磷酸根离子反应生成片状的磷酸钙盐并沉积到贝壳表面。从图4给出的EDS数据表明，样品在PBS中浸泡1 d后表层的Ca/P比较高。其原因是，生成的磷灰石不多，数据源于磷灰石与方解石或文石的混合物。浸泡3 d后两种贝壳的Ca/P比都明显降低，表明在表层上已覆盖了大面积的磷灰石。浸泡1 d和3 d后扇贝样品表面沉积物的Ca/P较小，表明扇贝样品表面的沉积速率高于褶纹冠蚌样品。浸泡5 d后两种贝壳的Ca/P比趋于稳定，约为1.4。标准羟基磷灰石的Ca/P比为1.67，表明在PBS中浸泡后生成的是缺钙型羟基磷灰石。

图4

图4 扇贝和褶纹冠蚌贝壳样品在PBS中浸泡后表面Ca/P的变化

Fig.4 Changes in Ca/P ratio of Pectinideaand Plicata shell samples after soaking in PBS

C a C O_{3} \to C a^{2 +} + C O_{3}^{2 -}

(1)

碳酸钙分解后产生的钙离子，使溶液的钙离子浓度提高。由图5可见，浸泡扇贝的PBS中钙离子的浓度高于浸泡的褶纹冠蚌的PBS，表明在相同的时间内扇贝表层发生的分解反应速度更高。而同在这个阶段，两种贝壳浸泡后PBS的pH值都增大，因为溶液中发生了水解反应

C O_{3}^{2 -} + H_{2} O \to H C O_{3}^{-} + O H^{-}

(2)

图5

图5 扇贝和褶纹冠蚌贝壳样品在PBS中浸泡不同时间后溶液中Ca²⁺与P⁵⁺浓度和pH值的变化

Fig.5 Changes of Ca²⁺ and P⁵⁺ concentrations and pH value of Pectinidea and Plicata shell samples after soaking in PBS for different time

CO $_{3}^{2 -}$ 与水电离的H⁺结合生成HCO $_{3}^{-}$ ，使溶液中的氢氧根浓度高于大于氢离子浓度，也使溶液的pH值升高。浸泡3 d后溶液中钙离子浓度略有提高，因为表层不仅发生了碳酸钙的分解反应，还发生了合成磷灰石的反应

(10 - x / 2) C a^{2 +} + x H P O_{4}^{2 -} + (6 - x) P O_{4}^{3 -} + (2 - x) O H

\to C a_{10 - x / 2} (H P O_{4}) x (P O_{4})_{6 - x} {(O H)}_{2 - x}

(3)

其中0≤x<2。生成的磷灰石沉积在贝壳的表层，分解反应产生钙离子的速度略高于生成磷灰石消耗钙离子的速度，使溶液中的钙离子浓度略有提高。而在此阶段，浸泡两组样品溶液中的pH值均下降，因为磷酸根发生了分步水解

H_{2} P O_{4}^{-} \to H P O_{4}^{2 -} + H^{+}

(4)

和

H P O_{4}^{2 -} \to P O_{4}^{3 -} + H^{+}

(5)

这是此阶段主要的水解反应，溶液中氢离子的浓度提高而溶液的pH值下降。浸泡5 d后的废液中各离子的浓度表明，发生的主要反应为式(1)和式(2)。因此，钙离子的浓度继续略有提高，而磷酸根的水解反应趋于平衡使溶液的pH值几乎不变。在全部阶段磷离子的浓度几乎不变，因为PBS溶液含有高浓度磷离子，式(3)中的反应消耗的磷离子与溶液中的磷离子相比很少。

根据以上分析，钙离子在磷灰石结晶过程中发挥了重要作用，而PBS中的钙离子浓度的高低取决于生物文石的溶解。很明显，两种不同的微观结构表现出不同的溶解度：在相同的时间内扇贝表层发生的分解反应速度更高，因为贝壳的结构和无机物的组成都不同。

2.3 贝壳浸泡在SBF溶液中磷灰石在其表面的生长

图6a，b给出了褶纹冠蚌和扇贝样品浸泡在PBS中5d后再在SBF中浸泡不同时间，扇贝和褶纹冠蚌贝壳的原始表层和在37℃的SBF溶液中浸泡后表层的XRD谱。对比发现，在SBF溶液中浸泡5 d后两种样品的XRD谱中均出现了磷灰石的特征衍射峰。特征衍射峰较宽而强度较弱，表明用化学浸泡法制备的磷灰石结晶度较低，晶体结构与生物磷灰石相似。与浸泡10 d和15 d的衍射谱对比可见，属于磷灰石的特征衍射峰逐渐增强，表明样品表层磷灰石的含量提高。

图6

图6 扇贝和褶纹冠蚌贝壳样品在PBS预处理后在SBF溶液中浸泡5、10和15 d后的XRD谱

Fig.6 XRD patterns ofPectinidea (a) and Plicata (b) shell samples firstly treated in PBS for 5 d and then soaked in SBF for different times

贝壳样品在PBS溶液中浸泡5 d后再放入SBF溶液中浸泡不同时间，随着浸泡时间的增加表层长出了一些微小的针状或片状晶体，并聚集成球状、花瓣状团簇或者不规则形状的颗粒(图7)。在PBS中浸泡的贝壳再在SBF溶液中浸泡后表层溶解，产生的Ca²⁺使贝壳表面附近模拟体液中的Ca²⁺、HPO $_{4}^{2 -}$ 、PO $_{4}^{3 -}$ 离子的浓度提高。当贝壳表层周围的钙磷离子浓度达到成核临界值时，磷灰石即在贝壳表面形核。Ca²⁺、HPO $_{4}^{2 -}$ 、PO $_{4}^{3 -}$ 等离子间的化学键合等作用使晶核长大，长大到一定尺寸即成为稳定核。稳定的晶核消耗周围环境中的Ca²⁺、HPO $_{4}^{2 -}$ 、PO $_{4}^{3 -}$ 、CO $_{3}^{2 -}$ 等离子而生长成微小的针状或片状，并聚集成各种形状的磷灰石颗粒^[21]。

图7

图7 用PBS预处理后扇贝和褶纹冠蚌贝壳样品在SBF溶液中浸泡5、10和15 d的SEM照片

Fig.7 SEM images showing the surface morphologies of Pectinidea (a~c) and Plicata (d~f) shell samples soaked in SBF for 5, 10 and 15 d, respectively

对比处理时间相同的扇贝和褶纹冠蚌可见，磷灰石晶体在扇贝表面生长的速度更高，磷灰石层的厚度也增加得更多，最终填满片状磷灰石间的空隙。这表明，扇贝的体外生物活性比褶纹冠蚌更好。

贝壳在PBS溶液中浸泡后，在其上生成的磷灰石为缺钙型磷灰石。晶格中缺少钙离子，使PO $_{4}^{3 -}$ 、HPO $_{3}^{2 -}$ 等阴离子过量。将其再浸泡到SBF溶液中，过量的阴离子吸引溶液中的Ca²⁺离子，使贝壳表层局部的过饱和度提高，从而促进了类骨型磷灰石的生成。磷灰石晶格中的离子被部分取代，使磷灰石的结晶度降低，其晶体结构与人的自然骨类似。图8给出了根据EDS分析贝壳表面微区元素含量得到的Ca/P比。从图8可见，在SBF中浸泡时间较短时样品表层的Ca/P较低。其原因是，之前浸泡在PBS溶液中磷灰石中部分钙离子被磷酸缓冲液中的钠离子取代，生成的磷灰石是缺钙型磷灰石。随着在SBF中浸泡时间的延长，表层发生了溶解-再沉淀，吸附了溶液中的钙离子而使Ca/P比值略有增大。

图8

图8 浸泡在SBF中扇贝和褶纹冠蚌贝壳样品表面的Ca/P比值

Fig.8 Changes in Ca/P ratio of Pectinidae and Plicata shell samples after soaking in SBF

这表明，在浸泡的短时间内在扇贝表面生成磷灰石晶体的速度更高，磷灰石层的厚度增加得更多。但是，长时间浸泡后在两种结构表面生成的磷灰石层没有太大的差异。因此，交叉叠片结构在短期内具有较好的生物活性，可替换生物材料用于快速修复硬组织的仿生结构设计。

3 结论

(1) 扇贝具有方解石晶型交叉叠片结构，褶纹冠蚌贝壳具有文石晶型珍珠质结构。扇贝和珍珠蚌贝壳在PBS中浸泡的初始阶段，将方解石或文石(碳酸钙)转化为磷灰石的能力不同。在具有交错层状结构的扇贝表面沉积的磷灰石更紧密，沉积较快。

(2) 在SBF中的长期体外矿化过程中，在短期内扇贝具有较好的体外生物活性，在长期内两种结构都表现出优异的生物活性。

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