李玉海
, 卢世松
LI Yuhai, LU Shisong
中图分类号: TB321, TG174
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收稿日期: 2013-11-7
网络出版日期: --
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摘要
优化了纯钛微弧氧化膜的制备工艺。将用优化后工艺制备的微弧氧化膜进行碱化处理, 然后置于模拟体液(SBF)中培养, 以观察其生物活性的优劣。采用正交设计法优化了实验方案, 用综合评分法分析了氧化膜的孔隙率、孔密度和孔直径, 确定最佳工艺条件为: 正向电压400 V, 占空比60%, 频率550 Hz, 氧化时间25 min。对在最佳工艺条件下制备的膜层进行了XRD、SEM和EDS测试, 结果表明: 优化工艺后生长的膜层由锐钛矿型的TiO2组成, 陶瓷层表面分布大量微孔, 孔隙率为0.70×108, 孔密度为12%, 孔径约为3 μm。经碱化处理的膜层置于模拟体液中培养14 d后, 膜层表面被生长出的类骨磷灰石完全覆盖, 证明其具有良好的生物活性, 且生长出的缺钙型磷灰石与人体自然骨成分相似。但是, 随着培养时间的延长磷灰石层发生溶解。
关键词：
Abstract
The preparation parameters were systematically optimized in order to produce an appropriate micro-arc oxidation (MAO) coating on pure titanium. Then the optimized MAO ceramic coating was subjected to alkali treatment. The bioactivity of the alkalized coating was evaluated by immersion test in a simulated body fluid (SBF) for certain times. The porosity, pore density and pore diameter of the MAO coatings were examined by formula scoring method. The results show that the best MAO may be produced with the following electrical parameters: positive voltage 400 V, duty ratio 60%, frequency 550 Hz, and oxidation time 25 min. The results of examination by XRD, SEM and EDS show that a uniform porous anatase TiO2 coating grew on titanium with porosity 12%, pore density 0.70×108, and a mean pore diameter 3 μm. The alkalized coating treated by alkali method was completely covered by bone-like apatite when it was cultured in SBF for 14 days. The calcium deficiency like apatite with a composition similar to that of human bone grew on the coating exhibits excellent bioactivity. But the apatite could dissolve with the extension of the culturing time.
Keywords：
在钛表面处理技术中, 微弧氧化(micro-arc oxidation)越来越受到人们的关注。用该技术可在钛金属表面原位生长致密的、与基体结合紧密的TiO2陶瓷氧化膜。这种氧化膜可诱导生成具有良好生物活性的磷灰石。但是人们对提高陶瓷层表面积, 进而为羟基磷灰石生长提供条件方面的研究还不够[1], 且大多用简单的单因素法和基础正交优化方法选取电参数[2–4]。
在微弧氧化膜制备过程中, 选取合适的电参数是得到具有良好生物活性TiO2膜层的前提。为了评价TiO2陶瓷膜的性能, 需要综合评价孔隙率、厚度、粗糙度及耐磨耐蚀等多项指标。对于多指标的正交实验, 指标的不可比性和矛盾性使实验方案的评价变得复杂和困难[5]。全伟[6]、邓妹皓[7]、郑宏晔[8]等用综合平衡法制备微弧氧化膜层, 但大多是关于电解液的选取, 没有涉及电参数的选取。
虽然综合平衡法能清晰反映各因素对指标的影响, 但在综合平衡时往往无法决定因素的主次。综合评分法是综合比较各种指标的重要性及其实测值, 对每号实验结果评定出一个综合分数, 以此分数作为单指标进行统计分析[9, 10]。本文以正交设计法优化实验方案, 采用综合评分法对方案结果进行分析, 选取孔隙率、孔密度与孔直径3个指标进行综合评价, 以优化微弧氧化工艺。然后将用优化工艺制备的TiO2陶瓷膜进行碱化处理[11], 最后置于模拟体液(SBF)中培养, 以判定其生物活性的优劣。
实验用基体材料为纯钛(TA2), 其化学成分列于表1。用线切割将纯钛加工成尺寸为15 mm×10 mm×1 mm的薄片, 用砂纸打磨并用去离子水和丙酮超声清洗。微弧氧化电解液由0.08 mol/L Na2HPO4和0.04 mol/L KOH的混合溶液配制[3]。实验中使用双向脉冲电源, 负向电压固定为60 V, 不锈钢板为阴极, 钛片为阳极, 在微弧氧化过程中不断搅拌使电解液体系离子均匀。
表1 纯钛TA2的化学成分
Table 1 Chemical compositions of TA2 (mass fraction, %)
| Element | C | Fe | Si | N | H | Ti |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 0.20 | 0.03 | 0.15 | 0.05 | 0.15 | Margin |
关于微弧氧化优选工艺, 选用五因素四水平L165)进行正交实验, 因素水平列于表2, 以确定各工艺条件对氧化膜性能的影响。将孔隙率(
表2 正交优化实验因素水平表
Table 2 Factors and levels in orthogonal design
| Level | Factor A | Factor B | Factor C | Factor D |
|---|---|---|---|---|
| Positive voltage ∕ V | Frequency ∕ Hz | Duty ratio ∕ % | Oxidation time ∕ min | |
| 1 | 350 | 500 | 50 | 10 |
| 2 | 400 | 550 | 55 | 15 |
| 3 | 450 | 600 | 60 | 20 |
| 4 | 500 | 650 | 65 | 25 |
在正交实验结果的评定方法中, 公式评分法适用于各项指标重要程度存在差异的情况。该方法使用一个包含各项指标加权系数(权值)的公式计算实验结果的综合评分。加权系数的大小由指标的重要程度决定, 指标越重要加权系数越大。将每一指标的评定得分乘以相应的加权系数, 得到该项指标的加权评分。再把每号实验的所有指标的加权评分相加, 即得综合评分。
将用优化工艺制备的试样先后用无水酒精和去离子水超声清洗, 烘干后置于5 mol/L的NaOH溶液中, 60℃下保温24 h, 晾干后装入自封袋保存[3]。将碱化后的样品分两组置于模拟体液(simulated body fluid, SBF)中, 并在(37±0.5)℃保持恒温, 每2 d换一次模拟体液, 分别培养14 d和21 d, 使植入体表面生长钙磷物质。SBF的配方列于表3[12]。
表3 模拟体液配方
Table 3 Reagents for preparation of SBF(1 L, pH=7.25)
| Order | Reagent | Amount |
|---|---|---|
| 1 | NaCl | 7.996 g |
| 2 | NaHCO3 | 0.350 g |
| 3 | KCl | 0.224 g |
| 4 | K2HPO43H2O | 0.228 g |
| 5 | MgCl26H2O | 0.305 g |
| 6 | 1 mol/L HCl | 40 mL |
| 7 | CaCl2 | 0.278 g |
| 8 | Na2SO4 | 0.071 g |
| 9 | (CH2OH)3CNH2 | 6.057 g |
使用计算机图像处理软件分析和处理获取的扫描电镜(SEM)图像, 以测量孔隙率[13-16]。在本实验中, 需要提供较大表面积的磷灰石作为外延生长基体, 而氧化膜内部的孔结构对生物活性的测定并不重要, 且微弧氧化表面形貌是非常均匀的。使用Image-Pro plus 6.0软件对10张相同工艺参数下制备氧化膜的SEM图像进行处理, 计算膜层的孔隙率、孔密度及孔直径, 并求出其平均值。
用S-3400N型扫描电子显微镜观察膜层表面及沉积物的形貌, 并进行表面元素分析; 用Rigaku D/Max UItima IV型X射线衍射仪分析膜层及沉积物的相组成。
正交设计的实验方案及结果列于表4。在实验过程中, No.15、No.16样品实验所得膜层烧蚀严重(图1), 故有些数据不能采集。出现此烧蚀现象, 与工作电压(500 V)密切相关。据文献报道[17], 作用电压增大, 电流密度随之增大, 作用在氧化膜上的能量随之增大, 进而产生较大的电弧, 使膜层甚至基体烧蚀。
表4 实验方案及结果数据表
Table 4 Design and result of the orthogonal test
| No. | Factors∕Levels | Experimental targets | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| A | B | C | D | Error | Diameter/µm | PPI/（×10 | ε/% | ||
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1.5 | 0.63 | 9.9 | |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | 1.5 | 0.61 | 11.0 | |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 3 | 1.6 | 0.62 | 11.3 | |
| 4 | 1 | 4 | 4 | 4 | 4 | 2.0 | 0.51 | 10.6 | |
| 5 | 2 | 1 | 2 | 3 | 4 | 2.5 | 0.41 | 11.1 | |
| 6 | 2 | 2 | 1 | 4 | 3 | 3.0 | 0.72 | 12.1 | |
| 7 | 2 | 3 | 4 | 1 | 2 | 2.8 | 0.65 | 12.8 | |
| 8 | 2 | 4 | 3 | 2 | 1 | 4.0 | 0.44 | 11.7 | |
| 9 | 3 | 1 | 3 | 4 | 2 | 4.0 | 0.33 | 11.7 | |
| 10 | 3 | 2 | 4 | 3 | 1 | 4.0 | 0.37 | 10.9 | |
| 11 | 3 | 3 | 1 | 2 | 4 | 4.0 | 0.33 | 10.6 | |
| 12 | 3 | 4 | 2 | 1 | 3 | 4.0 | 0.29 | 9.9 | |
| 13 | 4 | 1 | 4 | 2 | 3 | 5.0 | 0.23 | 12.1 | |
| 14 | 4 | 2 | 3 | 1 | 4 | 5.0 | 0.38 | 12.0 | |
| 15 | 4 | 3 | 2 | 4 | 1 | — | — | — | |
| 16 | 4 | 4 | 1 | 3 | 2 | — | — | — | |
结合表格数据, 对正交实验结果采用公式评分法进行处理。先对各指标结果打分[18, 19]。孔直径指标, No.13与No.14实验所得孔径为5.0 µm, 排在第一位, 记1分; No.1实验结果为1.5 µm, 排在末位, 记0分。孔隙率指标, No.6实验结果排在第一位, 记1分; No.13实验结果排在末位, 记0分。孔密度指标, No.7实验结果排在第一位, 记1分; No.1和No.12实验结果排在末位记0分。对其它号实验各指标值的得分, 使其与该指标优秀值的差异按比例打分。
加权系数的大小, 体现各项指标的重要程度。在本实验中, 孔隙率直接影响膜层的表面积, 进而决定氧化膜生物活性的优劣, 故设定其加权分数为3; 孔密度次之, 加权分数为2; 孔直径对膜层活性影响最小, 设定其加权分数为1。因此氧化膜综合评分公式为: 综合评分=3×ε+ 2×PPI+孔直径。
公式评分法的结果数据见表5。
表5 公式评分法结果数据表
Table 5 Results of the formula scoring method
| No. | Score of experimental target | |||
|---|---|---|---|---|
| Diameter | PPI | ε | Comprehensive Score | |
| 1 | 0 | 0.82 | 0 | 1.64 |
| 2 | 0.03 | 0.78 | 0.38 | 2.73 |
| 3 | 0.03 | 0.80 | 0.48 | 3.07 |
| 4 | 0.14 | 0.57 | 0.24 | 2.00 |
| 5 | 0.29 | 0.37 | 0.41 | 2.26 |
| 6 | 0.43 | 1.00 | 0.76 | 4.71 |
| 7 | 0.37 | 0.86 | 1.00 | 5.09 |
| 8 | 0.71 | 0.43 | 0.62 | 3.43 |
| 9 | 0.71 | 0.20 | 0.62 | 2.97 |
| 10 | 0.71 | 0.29 | 0.34 | 2.31 |
| 11 | 0.71 | 0.20 | 0.24 | 1.83 |
| 12 | 0.71 | 0.12 | 0 | 0.95 |
| 13 | 1.00 | 0 | 0.76 | 3.28 |
| 14 | 1.00 | 0.31 | 0.72 | 3.78 |
| 15 | — | — | — | — |
| 16 | — | — | — | — |
根据公式计算得出综合评分, 得出极差分析表(表6)。
表6 公式评分法极差分析表
Table 6 Statistical results of the formula scoring method
| Factor | Comprehensive score | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| A | B | C | D | E | ||
| K1 | 9.44 | 10.15 | 8.18 | 11.46 | 7.38 | ∑＝40.05 |
| K2 | 15.49 | 13.53 | 5.94 | 11.27 | 10.79 | |
| K3 | 8.06 | 9.99 | 13.25 | 7.64 | 12.01 | |
| K4 | 7.06 | 6.38 | 12.68 | 9.68 | 9.87 | |
| k1 | 2.36 | 2.54 | 2.73 | 2.87 | 2.46 | |
| k2 | 3.87 | 3.38 | 1.98 | 2.82 | 3.60 | |
| k3 | 2.02 | 3.33 | 3.31 | 2.55 | 3.00 | |
| k4 | 3.53 | 2.13 | 3.17 | 3.23 | 2.47 | |
| Range | 1.85 | 1.25 | 1.33 | 0.68 | 1.14 | |
| Secondary factors | A C B D | |||||
| Excellent scheme | A2C3B2D4 | |||||
优化后的电参数为: 正向电压400 V, 占空比60%, 频率550 Hz, 氧化时间25 min。
根据优化后得出的实验参数制备出微弧氧化膜, 其表面形貌如图2所示。从图2可以看出, 微弧氧化后氧化膜为灰色, 表面较平整。利用Image-Pro plus软件计算得膜层的孔隙率为12%, 孔密度为0.70×108, 孔直径约为3 µm。
图2 工艺优化后膜层表面形貌
Fig.2 SEM images of coatings’ surface after process optimization, Fig.b is partial enlarged image of Fig.2a
由图2可观察到, 氧化膜无裂纹, 膜上具有类似火山口的细小微孔, 微孔直径分布均匀。之所以出现这些微孔, 是因为在氧化的最初阶段形成的绝缘膜较薄。随着电压的升高, 较薄的绝缘膜发生火花放电。火光放电时钛基体反应生成氧化膜, 同时放出大量的热; 火光放电区域与溶液之间巨大的温差导致膜层中的溶液汽化, 而气体的排出则在膜层中留下空洞。这些微孔, 正是阳极析出气体的通道。
图3给出了优化后膜层的截面图像。图3中右侧为纯钛基体, 中间为陶瓷层, 左侧为镶样用的树脂, 靠近基体的膜层部分为致密层, 外侧为疏松层。由图3可见, 膜内层较致密, 与基体结合紧密, 呈交错咬合状, 可推知膜层与基体有相当程度的结合力; 膜外层较疏松, 不仅能够增大组织细胞的附着面积, 而且诱导细胞向孔内生长。从膜层截面放大形貌可见, 膜层有一定的粗糙度, 对后期磷灰石的大量生长极其有利。
图3 工艺优化后膜层截面形貌
Fig.3 SEM photograph on cross sections of coating after process optimization
无论是细小均匀的微孔, 还是粗糙不平的表面, 都增加了膜层的表面积, 从而在一定程度上有利于材料表面对液体介质润湿性的提高, 进而有利于细胞的附着和生长。
表7给出了氧化膜表面元素组成与含量。表7中的数据表明, 膜层表面化学组成主要为O、Ti和P, 其中O的原子分数最大, 超过67%, P大于8%, P来自电解液, 主要以磷酸盐形式存在于陶瓷层非晶中[20]。
表7 膜层表面元素组成
Table 7 Elemental composition of the surfaces of coatings
| Element | Atomic fraction ∕ % |
|---|---|
| O | 67.52 |
| P | 8.66 |
| Ti | 23.82 |
图4给出了最佳工艺条件所得氧化膜层的XRD谱。从谱中可以看出, 各衍射峰尖锐, 说明体系结晶度较好。根据衍射峰的强度, 陶瓷层主要由锐钛矿型TiO2组成, 其中Ti的衍射峰来自基体。涂层中相组成只生成了锐钛矿型TiO2, 组成单一, 而且经X射线衍射处理软件JADE可以算出, 锐钛矿相的晶粒尺寸为45.1 nm, 是纳米晶体材料。
当TiO2植入肌体后, 肌体会对植入片表面表现出异物反应, 具体为吞噬异物或者包裹异物(通常形成纤维包裹层)。这种包裹需要一定的时间, 在这段时间内材料表面与组织液间发生物理、化学变化, 对材料的骨性结合起着关键性作用。凡能在纤维包裹层形成前, 在材料表面形成类骨质钙磷矿化层的材料, 则无论材料内部成分怎样, 只要对生物组织无毒或化学性质稳定, 均可与骨组织形成骨性结合[7]。而对于锐钛矿型TiO2, 因其表面富含Ti-OH基团而带有微弱的负电荷, 可通过静电力吸引钙离子、通过氢键吸附磷酸根离子。这有利于提高膜层表面的过饱和度并促进磷酸钙的异质形核, 从而有较强的诱导类骨磷灰石形成的作用。在纳米尺度内, 晶粒尺度的减小可显著提高颗粒的比表面积, 晶粒表面产生更多的电子-空穴对并在表面参与氧化还原反应[21]。在XRD谱中观察到纳米尺度锐钛矿TiO2的存在, 说明所制作的膜层有较强的生物活性。
图5给出了微弧氧化钛经碱化处理后, 再放入模拟体液培养不同天数后的表面形貌。与未培养的膜层相比(图3), 培养14 d后“火山口”消失(图5a), 膜层表面被球状堆积物完全覆盖, 并出现一些微裂纹。初步推测这些球状堆积物质为类骨磷灰石, 说明微弧氧化钛经碱化处理后生物活性得到改善, 即膜层诱导磷灰石形成的能力增强。出现龟裂现象的原因, 可能是试样在取出干燥时水分子蒸发, 沉积层因脱水收缩而致使表面出现裂纹。但是随着培养时间进一步增加到21 d(图5b), 沉积层非但没有继续增厚而是变薄甚至消失, 且“火山口”形貌再次出现, 并以孔洞为中心聚集了许多“绒毛”状的物质。膜层上的裂纹, 可能是碱化完毕后膜层脱水收缩形成的。
图5 纯钛微弧氧化膜经碱化处理后置于模拟体液中培养不同时间后的表面形貌
Fig.5 SEM images of the surfaces of NaOH treated Ti coatings cultured in SBF for14 d (a) and 21 d (b)
表8列出了碱化处理后的膜层置于SBF中培养不同时间后的表面元素及其含量。培养14 d后在膜层中已检测不到Ti元素, Ca元素原子分数为16.64%, P元素为14.19%, 钙磷含量比为1.17, 与1.67(羟基磷灰石中的钙磷比)有差距; 培养21 d后再次检测到Ti元素的存在, 且钙磷含量大幅下降, 钙磷比为1.01, 与1.67的差距进一步增大。由此可推知, 膜层上生成的物质是非化学计量的磷灰石, 即缺钙的磷灰石。缺钙磷灰石涂层的形成, 是因为涂层中部分Ca
表8 碱化处理后的膜层置于模拟体液培养不同天数后的表面元素组成
Table 8 Elemental composition of the surfaces of NaOH treated Ti coatings after cultured in SBF for different days (atomic fraction, %)
| Element | Composition | |
|---|---|---|
| 14 d | 21 d | |
| Ti | 0 | 17.85 |
| O | 69.17 | 78.26 |
| P | 14.19 | 1.94 |
| Ca | 16.64 | 1.96 |
| Ca ∕ P | 1.17 | 1.01 |
图6给出了碱化处理后的微弧氧化钛膜层放入SBF中培养不同天数后的XRD谱。可观察到培养14 d后, XRD谱出现了大量羟基磷灰石的衍射峰, 证明膜层上已长出并覆盖了结晶态的羟基磷灰石, 其生物活性是优秀的; 培养21 d后膜层中并无任何新相产生, 说明虽然膜层中可以检测到Ca、P元素。但是这两种元素并没有以磷灰石的形式存在, 只是单纯地进入膜层中。
图6 纯钛微弧氧化膜经碱化处理后置于模拟体液中培养不同天数后表面沉积物的XRD谱
Fig.6 XRD patterns of the precipitation on the surfaces of NaOH treated Ti coatings after cultured in SBF for different days
将碱化处理后的试样在模拟体液中培养, 膜层表面的钛酸钠发生溶解并释放出Na+。Na+与溶液中的H3O+交换, 进而在材料表面形成带负电荷的Ti—OH基团。带负电荷的Ti—OH基团吸引Ca
但是, 当磷灰石长大到一定程度后发生一定程度的溶解。溶解起始于颗粒表面的非均匀部分, 如凸起、裂纹等, 随后向内部扩展[22]。发生溶解时, 磷灰石的OH
因此, 在培养初期模拟体液中的离子在膜层表面形核并长大, 但随着培养时间的延长磷灰石完全覆盖于陶瓷层表面。因此在磷灰石的凸起等非均匀部分的离子浓度高于其周围环境的离子浓度, 磷灰石发生溶解。此时溶解反应和沉积反应共存, 但溶解现象随培养时间的延长而加剧。当溶解反应的速度大于沉积反应的速度时, 类骨磷灰石层逐步消解。
磷灰石的溶解有利于陶瓷层与骨的结合, 因为磷灰石的溶解造成细胞膜内外Ca2+浓度差的扩大, 极大地提高了细胞活性; 同时, P元素参与多种有关细胞能量的代谢, 从而为有关反应提供足够的能量[23]。总之, 磷灰石溶解造成Ca2+和P元素的浓度差。这种浓度差对骨组织的生长产生刺激作用, 使种植体材料与骨更加紧密的结合。
1. 以0.08 mol/L Na2HPO4和0.04 mol/L KOH的混合溶液为电解液, 采用正交优化和公式评分法可优化微弧氧化工艺: 正向电压400 V, 占空比60%, 频率550 Hz, 氧化时间25 min。
2. 采用最优工艺对纯钛进行微弧氧化处理, 可制备出外层疏松、内层致密的TiO2膜层。该膜层以单一的锐钛矿型TiO2陶瓷结构为主, 其孔隙率为12%, 孔密度为0.70×108, 孔径均匀且在3 µm上下, 这些极大地增加了膜层的表面积。
3. 将碱化处理的TiO2膜层置于模拟体液中, 培养14 d后膜层表面即被类骨磷灰石完全覆盖, 生长出的缺钙型磷灰石与人体自然骨成分相似。但是, 随着培养时间的延长磷灰石层发生溶解。
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