刘淑琼
LIU Shuqiong
中图分类号: TB324
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收稿日期: 2014-04-25
修回日期: 2014-06-6
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摘要
以二氧六环/水为溶剂体系, 以聚己内酯(PCL)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)为原料, 采用相分离法制备纳米纤维支架, 研究了陈化、溶剂比例和PVP含量对支架的纳米纤维结构形成的影响, 以及PVP的添加对支架生物活性和亲水性能的影响。结果表明, 陈化直接影响纳米纤维网络结构的形成; 溶剂体系和PVP含量均影响纳米纤维结构, 随着PVP含量的提高纳米纤维结构逐渐消失。随着PVP含量的提高, 支架的亲水性能提高。PVP/PCL复合纳米纤维支架浸泡模拟体液(SBF)后在其内部和表面皆生成碳磷灰石(CHA)涂层, 表明该纳米纤维支架具有良好的生物活性, 且PVP/PCL支架比纯PCL支架能更快诱导生成碳磷灰石。
关键词：
Abstract
By using polycarpolactone (PCL) and polyvinylpyrrolidone (PVP) as raw materials, a series of nanofibrous scaffolds were fabricated by thermally induced phase separation in a dioxane/water system. The effect of aging temperature, PVP content and different ratios of dioxane to water on the morphology of nanofibrous scaffolds was investigated. The effect of PVP content on the biological activity and hydrophilic performance of the prepared nanofibrous scaffolds were also examined. The results show that aging process played a crucial role in forming the unique nanofibrous structure. The solvent system and the PVP content affect the nanofibrous structure, peculiarly; the nanofibrous structure would disappear gradually with the increasing PVP content. The result of the water absorption shows that the hydrophilic performance of the nanofibrous stent increases with the increasing PVP content. Furthermore, the test of biological activity shows that there exists crystallite carbonate hydroxyapatite in the scaffolds, indicating that the PCL/PVP nanofiberous scaffolds have a good biological activity, and which may much rapidly facilitate the forming of crystallite carbonate hydroxyapatite rather than the merely PCL ones.
Keywords：
聚己内酯(PCL)是一种半结晶性可降解聚酯材料, 具有良好生物相容性和力学性能。聚己内酯特殊的碳链结构使其具有很好的柔韧性和可加工性。大量实验证实, 它是一种可在体内缓慢降解、无毒、无免疫原性的材料, 广泛用于药物控释载体、软组织的缝合线、血管修复、骨缺损修复和组织工程支架制备[1-4]。PCL支架材料是一种比较成熟的可降解合成支架材料, 不足之处是聚己内酯属于聚酯, 亲水性较差, 缺乏与细胞的识别位点, 使其对细胞的粘附性不能满足要求。因此, 为了拓展PCL支架在组织工程中的应用必须改善其亲水性和生物相容性。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是一种合成的水溶性高分子聚合物, 具有优良的生理惰性, 不参与人体新陈代谢; 具有优良的生物相容性, 又具有类似蛋白性能的吡咯环、低的免疫原性、螯合作用等, 常用作血浆增稠剂和玻璃体替代物[5]。同时, PVP还与多种亲水和疏水材料相互作用, 有利于改善两者的相容性。因此, 将其引入PCL纳米纤维支架中有望改善PCL纳米纤维支架的亲水性和生物活性。含氮基团与细胞的相互作用更有利于细胞的黏附和生长作用[6], 因此在PCL基体中引入PVP不仅能在较大范围内调节材料的亲水性能和力学性能, 还可从多角度来促进细胞的生长。
热致相分离技术设备简易, 操作简单, 控制实验参数就可形成复杂的三维空间结构---类似于天然细胞外基质的结构[7, 8]。因此本文以二氧六环/水为溶剂体系, 采用相分离方法制备PVP /PCL纳米纤维支架, 研究陈化、溶剂比例和PVP添加量对纳米纤维结构形成的影响, 以及PVP的添加对支架生物活性和亲水性能的影响。
实验材料: 聚己内酯(PCL, 分子量80000); 聚乙烯吡咯烷酮(PVP, K30, 分子量10000); 1-4二氧六环(A.R.)。
(1) 将一定量的PCL和PVP(固定两者总量, 保持聚合物总浓度为10%)依次溶解在1, 4-二氧六环/水的溶剂体系(质量比分别为90: 10, 88: 12, 85: 15)中, 配成PVP质量分数分别为0%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30% (m(PVP)/(m(PCL)+m(PVP))×100%)的PVP/PCL溶液。将其在40℃恒温水浴中磁力搅拌溶解至均相溶液, 取均相溶液5 mL于25 mL小烧杯中, 置于设定温度(0℃)陈化3 h, 再放置于-20℃冷冻箱中冷冻2 h, 得到凝结成块的支架。然后用4-6℃蒸馏水浸泡该支架, 放置于4-6℃环境中, 1 d换水3-4次, 3 d后干燥样品并保存于干燥器中待用。
(2) 用类似的方法制备未经陈化的样品, 只是将配置好的溶液倒入小烧杯后直接置于-20℃冷冻箱中冷冻2 h, 后处理同(1)。文中探讨不同陈化条件和溶剂比例的样品均为PVP含量为10%的PCL/PVP复合支架; 除探讨溶剂比例的影响外, 其它样品的溶剂体系均为m(二氧六环)∶m(水)=90∶10。
用冷场发射电镜(FE-SEM, JSM-7500F)观察支架的内部形貌、孔径大小及浸泡SBF后材料沉积物的形貌, 样品采用液氮脆断并用刀片切出1 mm厚, 断面表面喷金150 s(旋转喷金仪, 30 mA), 测试条件: 电压: 5 kV, 电流10 mA; 用Nicolet Avatar 360傅立叶变换红外光谱仪测试材料沉积物的结构。测试条件为分辨率为4 cm-1, 扫描次数64次。
测定孔隙率[7]: 每个样品取三组, 平行测试, 最后取平均值; 测定吸水率: 将不同PVP含量的PCL支架先置于烘箱中烘干24 h, 称至恒重为W1, 然后置于二次蒸馏水中24 h, 取出样品, 用滤纸吸去表面水分, 称至恒重为W2, 然后计算吸水率W(%) [9], 每个样品取三组, 平行测试, 最后取平均值。W(%)=(W2-W1)×100/W1, 式中W1, W2分别为浸泡前后样品的质量(g); 测试体外生物活性: 将样品浸泡到1.5SBF(模拟体液)中, 然后置于37℃恒温水浴锅中, 分别浸渍4 d, 7 d, 14 d。每隔2 d更换一次溶液。浸渍后取出用蒸馏水漂洗, 然后干燥。参照文献[10] 配制1.5SBF模拟体液。
SEM结果表明, 支架在图1a条件下得到相互贯通的粗纤维网络结构, 纤维表面有少量孔洞, 呈多孔状。在图1b条件下则形成以纳米纤维网络为基体结构的支架。未经陈化的PVP/PCL复合支架未得到纳米纤维结构可能与该复合物的结晶形态有关系。只有结晶性聚合物才可利用相分离方法得到纳米纤维的结构[11-13], 主要是利用在相分离初期产生的微晶作为交联剂而使聚合物形成凝胶, 而凝胶是形成纳米纤维支架的必须因素。当PCL浓度大于10%以后, 即使未经陈化作用也可产生纳米纤维结构, 其关键也在于可以形成凝胶[8]。本文未经陈化的复合支架之所以不能产生纳米纤维结构, 可能是PVP的添加一方面影响了聚合物溶液在相分离初期的微晶形成, 另一方面也同时影响了PCL高分子链缠结的形成。这两方面的作用导致凝胶形成的交联剂的缺失, 故最终不能形成凝胶, 不能出现纳米纤维结构。
图1 有无陈化的PVP/PCL复合支架电镜照片(a) 直接-20℃冷冻2 h, (b) 先0℃凝胶3 h, 再-20℃冷冻2 h
Fig.1 Scanning electron micrographs of PVP/PCL scaffolds prepared from different condition (a) without aging; (b) with aging at 0℃ for 3 h
从图2可以看出, 随着非溶剂的增加纤维直径变大, 纤维结构逐渐变粗, 直至消失。非溶剂比例≤12%时可得到较为纤细的纤维[图2a和b], 而当非溶剂比例为15%时得到的纤维直径较粗大的纤维网络结构, 且出现纤维聚集成束的现象[图2c]。其原因是, 当非溶剂≤12%时溶剂体系的溶解性能相对较好, 溶液中的高分子链还是相互分开的, 相分离是从较为均相的溶液中析出的, 因此得到的纤维较为纤细, 直径大约为100-500 nm, 而细胞外基质中的纳米纤维直径为50-500 nm。当非溶剂比例≥15%时高分子链相互穿插交叠, 在后期的相分离中出现较大的相畴, 因此得到纤维较粗, 且成花簇状的多孔结构。
图2 不同溶剂体系的PVP/PCL复合支架电镜照片
Fig.2 Scanning electron micrographs of PCL/PVP scaffolds prepared from different weight ratio of dioxane/ water (a) 88/12; (b) 90/10; (c) 85/15
图3给出了不同PVP添加量的PCL/PVP复合支架的SEM图, 从图3可见, 未添加PVP的纯PCL支架是由均匀的纳米纤维网络结构构成的, 其纤维直径约为50-300 nm。当PVP添加量为5%时可看到纳米纤维网络结构仍然存在, 但其纤维直径有所增大[图3b], 且结构变得不均匀。当PVP的含量为10%时支架的基体是由微米尺度的纤维网络相互贯通构成的, 随着PVP含量的继续增加支架的形貌发生了改变, 支架的基体基本由直径较粗大的纤维网络结构构成, 纤维直径越来越大。当PVP的含量达到30%时纤维网状结构消失, 支架变成互相穿插的多孔网络结构。
图3 不同PVP含量的PCL/PVP复合支架的电镜照片
Fig.3 Scanning electron micrographs of PCL/PVP scaffolds prepared with different PVP ratio (a) 0%; (b) 5%; (c) 10%; (d) 15%; (e) 20%; (f) 25%; (g) 30%
由图4可见, 随着PVP含量的增加支架在浸泡14 d后表面的沉积物逐渐增多, 由未添加PVP支架的表面一层薄薄的覆盖物到添加30%PVP的支架表面的厚厚一层颗粒沉积物。电镜观测结果表明, PVP的添加有利于PCL支架生物活性的提高, 是PVP良好的亲水性、生物相容性[14]及对钙离子等有螯合作用的综合结果。对比图4c和图5a可以发现, 添加PVP后支架在浸泡4 d就已经比未添加PVP浸泡14 d沉积更多的物质了, 说明PVP的添加不仅有利于沉积物的生成, 而且其生长速度也更快。另外从图5可见, 随着浸泡天数的增加, 支架上的沉积物也逐渐的增加。
图4 不同PVP含量的PCL/PVP复合支架浸泡模拟体液14 d后的电镜照片
Fig.4 Scanning electron micrographs of PCL/PVP scaffold with with different ratio of PVP immersion in SBF with 14 d (a) 30%; (b) 20%; (c) 0%
图5 20%PVP含量的PCL/PVP复合支架浸泡模拟体液不同时间后的电镜照片
Fig.5 Scanning electron micrographs of the PCL/PVP scaffold immersion in SBF with the ratio of PVP is 20%. (a) 4 d; (b) 7 d; (c) 14 d
由图6可知, 位于3440 cm-1和1638 cm-1处的是水的特征峰, 位于583 cm-1, 600 cm-1处的为P-O的弯曲振动吸收峰, 位于959 cm-1, 1045 cm-1, 1064 cm-1处的是P-O的反对称伸缩振动吸收峰[15, 16], 其中1045 cm-1和1064 cm-1吸收峰分化程度低表明沉积的HAP结晶程度低[17]。837 cm-1和1400～1460 cm-1处的吸收带为CO32的特征吸收峰, 其中CO32在1400～1460 cm-1处出现了分裂, 呈1421 cm-1和1466 cm-1两个吸收峰, 它是区别于自由CO32或碳酸盐中的CO32的ν3单峰, 是碳酸根进入磷灰石结构的重要标志[15, 18, 19]。由此可以推断, 浸泡SBF后PCL纳米纤维支架表面形成了与人体骨头成分相似的弱结晶的碳磷灰石, 与哺乳动物硬组织的无机成分相似[20], 含碳酸根的碳磷灰石与天然骨成分更接近, 表明该PCL/PVP复合纳米纤维支架有较好的生物活性。
图6 PCL/PVP(30%) 支架浸泡模拟体液不同时间后的FTIR谱图
Fig.6 FTIR of PCL/PVP (30%) scaffold after immersed in SBF for (a) 0 d and (b) 14 d
由表1可以看出, 随着PVP含量的增加支架的吸水率也逐渐增加, 未添加PVP时支架的吸水率只有10.13%, PVP含量提高到30%支架的吸水率增加到42.29%, 说明PVP的添加能有效改善纯PCL支架的亲水性能。其原因是, PVP是水溶性高分子, 与PCL 复合后可明显提高支架中的亲水基团含量, 由此提高了支架的亲水性。
表1 不同条件的支架孔隙率、吸水率
Table 1 Porosity and water absorption rate of different condition scaffold
| Mass fraction of PVP (%) | Gelation temperature (℃) | Mass ratio of dioxane /water | Porosity (%) | Water absorption rate (%) |
|---|---|---|---|---|
| 0 5 10 15 20 25 30 10 10 10 10 10 | 0 0 0 0 0 0 0 -4 -6 0 0 — | 90/10 90/10 90/10 90/10 90/10 90/10 90/10 90/10 90/10 88/12 85/15 90/10 | 83.70 92.19 90.48 89.91 84.01 91.47 91.61 90.47 83.23 82.77 83.79 90.69 | 10.13 17.42 19.64 24.11 40.09 41.83 42.29 － － － － － |
支架的一个基本条件就是具有高的孔隙率, 为细胞的生长及营养的运输提供一个良好的通道。由表1可见, 添加PVP后支架的孔隙率上升, 但不是很明显, 且不同PVP添加量对支架的孔隙率影响没有明显的规律, 但彼此之间差异不大, 所有支架的孔隙率都在82%以上。其原因是, 纳米纤维结构由众多纳米纤维交织而成, 纤维与纤维之间有空隙, 无数的空隙是纳米纤维有高孔隙率的主要原因。这应该也是纳米纤维支架更有利于细胞繁殖的原因之一。
以二氧化六环/水为溶剂体系, 采用热致相分离法可制备具有高孔隙率的PCL/PVP复合纳米纤维支架。聚合物总浓度为10%时, 陈化直接影响纳米纤维网络结构的形成; 随着溶剂体系中非溶剂比例的增加纤维支架的孔隙逐渐变大, 且直径变粗, 纤维有聚集成束的趋势; 随着PVP含量的提高, 支架的纳米纤维结构逐渐消失, 亲水性能提高。PCL/PVP复合纳米纤维支架浸泡SBF后在其内部和表面皆有CHA涂层生成, 表明该纳米纤维支架具有良好的生物活性, 且PCL/PVP支架比纯PCL支架能较快诱导碳磷灰石的生成。
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