材料研究学报  2017 , 31 (8): 612-618 https://doi.org/10.11901/1005.3093.2016.525

研究论文

再生丝素/羧甲基壳聚糖膜的制备和性能

徐水12, 张岩12, 高保东12, 赵诏12, 成国涛12, 朱勇12

1. 西南大学生物技术学院材料纤维研究室 重庆 400715
2. 重庆市蚕丝纤维新材料工程技术研究中心 重庆 400715

Preparation and Properties of Composite Films of Silk Fibroin/Carboxymethyl Chitosan

XU Shui12, ZHANG Yan12, GAO Baodong12, ZHAO Zhao12, CHENG Guotao12, ZHU Yong12

1 College of Biotechnology, Laboratory of Fiber Materials of Southwest University,Chongqing 400715, China
2 Research Center of Silk Fiber Materials Engineering of Chongqing, Chongqing 400715, China

中图分类号:  TQ341.5

文章编号:  1005-3093(2017)08-0612-07

通讯作者:  通讯作者 徐 水,副教授,xushui@swu.edu.cn,研究方向为茧丝化学

收稿日期: 2016-09-8

网络出版日期:  2017-08-25

版权声明:  2017 《材料研究学报》编辑部 《材料研究学报》编辑部

基金资助:  重庆市蚕丝纤维新材料工程技术中心专项研究(SILKGCZX009),江苏省高校省级重点实验室开放研究课题(KJS1508)

作者简介:

作者简介 张 岩,女,1991年生,硕士生

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摘要

用二次冷冻干燥法制备出以戊二醛为交联剂的再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料,研究了不同配比的戊二醛/丝素/羧甲基壳聚糖膜的理化性质。结果表明:这种再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料具有联通的三维多孔结构,孔径分布均匀,丝素与羧甲基壳聚糖之间形成分子间氢键,相容性好;丝素与羧甲基壳聚糖的质量比为1:1,戊二醛的含量为0.20%时共混材料的力学性能最优,且热稳定性较好。植入皮下结果表明,这种复合材料具有良好的生物降解性和生物相容性。

关键词: 复合材料 ; 生物材料 ; 复合膜材料 ; 冷冻干燥 ; 再生丝素 ; 羧甲基壳聚糖 ; 相容性

Abstract

Composite films of regenerated silk fibroin/carboxymethyl chitosan were successfully prepared by quadratic freezing-drying method with glutaraldehyde as cross-linking agents, and then of which the physicochemical performance was characterized. The results show that the composite materials show a three-dimensional porous structure with uniform pore distribution; while there exists intermolecular hydrogen bonds between the silk fibroin and the carboxymethyl chitosan, thus they are compatible with each other; Among others, the prepared composite presents the best mechanical property and good thermal stability when the mass ratio of the regenerated silk fibroin to the carboxymethyl chitosan was 1:1 and the glutaraldehyde content was 0.20%. The composite material has also good biodegradability and biocompatibility.

Keywords: composite ; biomaterials ; composite membrane material ; lyophilization ; regenerated silk fibroin ; carboxymethyl chitosan ; biocompatibility

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徐水, 张岩, 高保东, 赵诏, 成国涛, 朱勇. 再生丝素/羧甲基壳聚糖膜的制备和性能[J]. 材料研究学报, 2017, 31(8): 612-618 https://doi.org/10.11901/1005.3093.2016.525

XU Shui, ZHANG Yan, GAO Baodong, ZHAO Zhao, CHENG Guotao, ZHU Yong. Preparation and Properties of Composite Films of Silk Fibroin/Carboxymethyl Chitosan[J]. Chinese Journal of Material Research, 2017, 31(8): 612-618 https://doi.org/10.11901/1005.3093.2016.525

属于天然动物蛋白的丝素(SF)来源较广,其生物相容性好且氨基酸组分对人体有保健功效,可用于制备医用高分子材料。为了改善纯丝素膜材料的物理性能,Yasutomo等[1]将SF与纤维素的比例作为自变量制备材料。结果表明,共混材料的弹性模量与纤维素的含量有线性关系;当SF质量分数为20%~30%时共混材料的力学性能最好,丝素的二级结构由无规则卷曲变为β-折叠。王朝霞等[2]制备的丝素(SF)/聚乙烯吡咯烷酮(PVP)共混膜,SF与PVP之间形成的氢键使复合膜的聚集状态发生改变。

羧甲基壳聚糖(CMCS)是壳聚糖的一种衍生物,属于两性多糖,具有保湿、水溶、增稠、乳化、无毒、凝胶、分散和成膜性[3]等优良性质。CMCS分子内部大量游离的氨基与羧基既能阻止丝素分子内形成氢键,又可与丝素分子中的氨基、羟基等形成分子间氢键,从而改变了复合材料的物理性能。

作为交联剂,戊二醛(GA)可与其他分子交联形成稳定的交联结构。GA具有两个化学性质非常活泼的醛基,可与蛋白质分子中多种官能团结合,还能与赖氨酸ε-氨基发生不可逆结合而形成交联。Feng等[4]将丝素溶液冷冻干燥制备丝素支架材料,在丝素溶液中添加少量的戊二醛溶液,支架材料的聚集态结构为β-折叠结构。用这种方法制备的支架材料,其机械性能及热稳定性较好。本文在SF中引入CMCS,以GA交联用二次冻干法制备一种新型复合组织工程材料,研究GA、CMCS和SF混合比例对该复合材料物理性能的影响并对其分子机制进行可能性分析。

1 实验方法

1.1 再生丝素溶液的制备

实验用材料为蚕茧;透析袋(截留量14000D)。制备方法如下,(1)脱胶:将适量的蚕茧壳剪成螺旋状,在0.5% Na2CO3溶液(浴比为1:50)中煮沸30 min后蒸馏水洗净,重复3次后室温晾干;(2)溶解:将摩尔质量比为1:2:8的三元溶剂(CaCl2、CH3CH2OH、H2O)在(70±5℃)的水浴下溶解丝素(浴比为1:10);(3)透析:将常温的丝素溶解液用蒸馏水透析,每隔4 h更换一次透析液。3 d后将其离心(4℃,6000 r/min)分离30 min,取上清液配制浓度为4%的丝素溶液置于4℃备用[5]

1.2 羧甲基壳聚糖溶液的制备

将适量的羧甲基壳聚糖粉末溶于体积分数为2%的乙酸溶液中,在室温磁力搅拌过夜,配制成质量体积分数为4%的羧甲基壳聚糖乙酸溶液,在4℃保存[6]

1.3 再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备

将丝素溶液(4%)/羧甲基壳聚糖溶液(4%)与甘油(2%)按表1中的数据进行全因子实验,按比例强力搅拌均匀后在4℃过夜消泡,24 h后倒入聚苯乙烯培养皿中,在-20℃预冻6 h后在-80℃冷冻过夜,冷冻干燥48 h后得到再生丝素/羧甲基壳聚糖初制复合材料。将制得的支架材料在75% CH3OH、1 mol/L NaOH(体积比为1:1)混合溶液中浸泡2 h,然后用去离子水冲洗2~3次,再次冷冻干燥后得到再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料。

表1   再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的制备

Table 1   Preparation process of regenerated fibroin/carboxymethyl chitosan composites

No.SF/CMCS(g/g)GA(%)
13:10.20
22:10.20
31:10.20
41:20.20
51:30.20
61:10.05
71:10.10
81:10.15
91:10

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1.4 性能表征

1.4.1 物理性能的测定 溶失率的测定:用烘干质量法测试复合材料的热水溶失率。将复合材料进行平衡处理。称取复合材料总质量后将其以1:100的浴比放入37℃的蒸馏水中恒温振荡1 h,取出后在60℃烘干至恒温。称取复合材料总质量,则热水溶失率为

(G1-G2)/G1×100%(1)

式中G1为平衡后的复合材料质量(g);G2为烘干后的复合材料的总质量(g)。

溶胀度的测定:用质量称量法测试复合材料的溶胀度。称取充分平衡后复合材料的质量,将其在20℃蒸馏水中浸渍24 h后取出,用吸水纸吸干复合材料表面水分并测量复合材料质量,则溶胀度为

(M2-M1)/M1×100%(2)

式中M1为充分平衡后的复合材料质量(g);M2为浸渍24 h后的复合材料的总质量(g)。

含水率的测定:在温度为20℃、湿度为65%的条件下使复合材料达到吸湿平衡,称其质量。将复合材料置于硅胶真空干燥器内24 h后称取此时质量,则含水率为

(W1-W2)/W1×100%(3)

式中W1为吸湿平衡后的复合材料质量(g);W2为真空干燥24 h后的复合材料的总质量(g)。

力学性能的测定:将所有复合材料用裁样刀裁成长条形试样,使用3个样品进行重复测试。用螺旋测微器测量复合材料的宽度、厚度,在AG-IC型万能力学试验机上固定复合材料,用5 mm/min的拉伸速度进行拉伸试验。测试温度为20℃,相对湿度为65%,其断裂强度为

Σ=F/(A·B)(4)

式中Σ为断裂强度(N/mm2),F为最大负荷(N),A为试样的宽度(mm),B为试样的厚度(mm)。

FTIR测试:用Varian 640型傅里叶红外光谱仪(FTIR)进行化学结构表征,将KBr和复合材料混合研磨后制成压片样品,分辨率4 cm-1,在500~4000 cm-1测试范围内进行32次扫描。

TG测试:用Pyris 6型热重分析仪(TGA)在氮气氛围保护下进行分析复合材料的热失重行为,样品质量5~10 mg,氮气流量19.4 mL/min,从30℃升温至800℃,升温速率为20℃/min。

SEM测试:将样品镀金1 min,用导电胶将处理样品固定于JSM-6510LV型扫描电镜铜片上, 观察复合材料的形态及孔隙。SEM扫描加速电压20 kV。

1.4.2 体内相容性的表征 实验材料:将12只健康ICR小鼠(雄性,8周龄,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,动物生产许可证号SCXK(京)2012-0001)进行动物适应3 d,在室温23℃、湿度60%条件下正常喂养。将复合材料制成尺寸为1×1×1 cm3的块状支架,放入无菌PBS溶液中浸泡后在紫外灯下照射30 min备用。

实验方法:对试验鼠腹腔注射乙醚,待鼠麻醉后将其固定于手术台上,剔除鼠背部皮毛,暴露皮肤。用75%乙醇消毒后选取试验鼠背部合适部位切开皮肤,用钝器在切口部位制取大小合适的皮下囊,将实验材料放入皮下囊并缝合。用消毒液消毒后进行肌肉注射青霉素钠(每只小鼠注射0.5 mL含有40万单位青霉素钠的生理盐水)以预防感染。麻醉清醒后自由进食水,正常饲养。分别在术后1,2,4周处死大鼠,从原切口切开将埋植的支架取出。用10%甲醛溶液固定支架材料24 h,石蜡包埋,HE 染色切片,在BA400麦克奥迪显微镜下观察。

2 结果与讨论

2.1 SF/CMCS共混材料的成型效果

材料的成型效果表明,一次冷冻干燥后的复合材料吸水性太强且在去离子水中易溶解,不适宜作支架材料。经过甲醇和氢氧化钠处理后二次冷冻干燥制备的复合材料吸水能力在可控范围内,且不易溶于水。未添加GA的复合材料在水中振荡5 min后溶解,加入GA的复合材料在去离子水中不溶解。成型的复合材料颜色呈白色或淡黄白色,具有一定弹性,压缩后可恢复原貌。结果表明,添加GA且二次冷冻干燥制备的复合材料成型效果好,更适用于制作支架材料。

2.2 SF/CMCS共混材料的物理性质

表2给出了不同配比复合材料的溶胀度、含水率和热水溶失率数据。在总体上,复合材料的溶胀度、保水率和热水溶失率随着CMCS含量的提高而增大。当SF:CMCS为2:1时,溶胀度达到最小值266.31%。其原因是,CMCS与SF分子形成氢键,并使SF分子的结晶度提高,从而降低了复合材料溶胀度;而含水率和热水溶失率在含量比值接近1:1时增加缓慢,因为两种材料分子间氢键接近饱和状态,使其增加减缓。当SF:CMCS小于1:1时溶胀度、保水率和热水溶失率显著增加。因为过量的CMCS分子形成分子内氢键,使CMCS与SF分子间氢键的作用力减弱,破坏了之前较为规整的结晶结构遭到,加之自身的无定形状态,从而将更多的亲水性基团释放出来[7]

表2   不同配比复合材料的热水溶失率、溶胀度和含水率

Table 2   Dissolution rate, swelling capacity and water content rate of different composites (%)

SF:CMCSDissolution
rate
Swelling
capacity
Water
content rate
3:156.55279.0324.30
2:158.66266.3132.54
1:159.41391.8732.89
1:277.37591.9634.33
1:380.37447.5133.78

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表3可以看出,随着戊二醛含量的增加,复合材料的热水溶失率、溶胀率和含水率均呈现下降的趋势。复合材料溶失率的下降是因为戊二醛的加入提高了复合材料的结晶度,并破坏了复合材料中丝素分子的亲水性基团,使亲水性基团减少,从而溶失率下降。溶胀度和含水率呈现下降的趋势,可能是戊二醛作为交联剂与羧甲基壳聚糖分子上的基团发生反应,导致羧甲基壳聚糖分子中亲水基团减少。

表3   不同戊二醛含量复合材料的热水溶失率、溶胀度和含水率

Table 3   Dissolution rate, swelling capacity and water content rate of different glutaraldehyde content (%)

GADissolution
rate
Swelling
capacity
Water
content rate
070.0042.47
0.0564.38914.8637.21
0.1064.35699.3933.63
0.1557.91643.0131.91
0.2059.41391.8732.89

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2.3 SF/CMCS共混材料的力学性能

图1给出了不同质量比的SF/CMCS膜的力学性能图。图1表明,随着CMCS含量的增加复合材料的拉伸强度先升高后降低。当SF/CMCS质量比为1:1至1:2时,复合材料的拉伸强度最优。由于复合材料中CMCS的存在,再生丝素分子中的电子受体与羧甲基壳聚糖分子中的电子供体相互作用形成较多的氢键,出现类交联网络结构,使链段运动困难,复合材料拉伸强度增加[8]。但是CMCS的继续增加使其形成分子内氢键,从而降低了复合材料的拉伸强度。

图1   不同配比复合材料的力学性能

Fig.1   Mechanicalproperies of different composites

图2给出了不同戊二醛含量的再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的力学性能谱图。从图2可以看出,戊二醛提高了再生丝素/羧甲基壳聚糖复合材料的力学性能,即拉伸强度。复合材料的拉伸强度随着戊二醛含量的增加而提高,含量达到0.2%时拉伸性能最优。戊二醛作为一种交联剂,其分子结构中有两个反应性活性醛基,可以与蛋白质分子中伯胺基、杂环上的亚氨基、巯基及酰胺基反应,形成共价交联,加强了分子间的相互作用。而且添加CMCS改性后的再生丝素蛋白出现β-折叠结构,二级结构由无规结构向有序结构转变,结构变得更稳定,从而使复合材料的拉伸强度增强[9]

图2   不同戊二醛含量复合材料的力学性能

Fig.2   Mechanicalproperies of different composites with different glutaraldehyde content

2.4 SF/CMCS共混材料的TG性能分析

图3给出了不同配比SF/CMCS共混材料的热失重曲线。由图3可见,复合材料出现两个热失重过程。在100℃附近的失热为复合材料中水分子的蒸发。随着温度升高材料还出现了一个明显的热失重阶段即纯丝素材料的热失重阶段,失重温度为331.5℃,这个阶段的热失重为丝素分子链的局部断裂和分子间力的断裂[10]。纯羧甲基壳聚糖材料的热失重温度为281.1℃,对应羧甲基壳聚糖分子中糖环的脱水和聚合物中羧甲基的分解断裂。而配比为3:1、2:1、1:1、1:2和1:3的共混材料,其热失重温度分别为257.3℃,255.8℃,259.3℃,274.4℃,271.9℃。可以看出,加入羧甲基壳聚糖后共混材料的热失重稳定性较纯丝素膜的热失重稳定性变差。其原因是,羧甲基壳聚糖是一种无定形结构,与再生丝素共混后羧甲基壳聚糖与再生丝素分子中-NH与-OH 等官能团之间形成氢键,在一定程度上破坏了再生丝素结构的规整性,从而使共混膜的热失重稳定性降低。但是,随着羧甲基壳聚糖含量的增加,羧甲基壳聚糖与再生丝素分子间氢键作用或分子间基团的相互作用增加,使复合材料的分子结构呈现类似交联结构。于是,随着羧甲基壳聚糖含量的增加共混材料的热失重稳定性有所提高。这与溶胀度、含水率和热水溶失率的变化规律几近一致。

图3   不同配比SF/CMCS共混材料的热失重曲线

Fig.3   Thermogravimetric curves of different SF/CMCS composites

图4给出了不同戊二醛交联剂含量的SF/CMCS共混材料的热失重曲线。从热失重曲线可以看出,共混材料有两个明显的热失重过程。第一个热失重过程在100℃附近,为共混材料中水分蒸发和甘油的挥发引起的吸收峰。第二个热失重过程在250℃以上出现,且出现两个并列的吸收峰,此处的吸收峰为共混材料分子链的局部断裂和分子间力的断裂。加入交联剂后共混材料的热失重稳定性有所提高,因为加入交联剂后共混材料中相邻大分子间相互结合力增加,大分子相互靠拢,分子链之间的相互作用力增加,形成网络结构,使其热失重稳定性也提高了。

图4   不同戊二醛交联剂含量的SF/CMCS共混材料的热失重曲线

Fig.4   Thermogravimetric curves of SF/CMCS composites with different glutaraldehyde content

2.5 红外光谱分析

图5给出了SF、CMCS及SF/CMCS膜红外光谱图。SF图谱中3288 cm-1左右谱带区域出现的单峰,是典型的蛋白质N-H伸缩振动特征吸收峰。1652 cm-1产生的吸收峰为C=O伸缩振动,为酰胺Ⅰ(无规卷曲)的特征吸收峰。1521 cm-1产生的吸收峰为N-H变形振动,为酰胺Ⅱ(β-折叠)的特征吸收峰。1235 cm-1产生的吸收峰为N-H变角和C-H伸缩振动,为酰胺Ⅲ(无规卷曲)的特征吸收峰。690 cm-1产生的吸收峰为N-H面外变形振动,为酰胺Ⅳ(β-折叠)的特征吸收峰[11]

图5   SF、CMCS及SF/CMCS共混材料的红外光谱图

Fig.5   FTIR spectra of SF, CMCS and SF/CMCS composites

CMCS图谱中3459 cm-1处的吸收峰为羟基伸缩振动,并因分子羟基间的氢键而形成了强宽峰,而且CMCS在此处的吸收峰远远高于纯丝素在此处的吸收峰。1186 cm-1处的吸收峰为C-O的伸缩振动峰。羰基吸收峰出现在1647 cm-1、1457 cm-1。CMCS的特征吸收峰是在1725 cm-1处的吸收峰,为羧基中C=O的伸缩振动吸收峰。

共混材料图谱为选取综合物理性能较优的SF:CMCS比为1:1的红外光谱图,该图谱表明3384 cm-1形成吸收峰。因为SF分子链与羧基之间形成氢键,降低了羟基间形成氢键的作用,所以该吸收峰较CMCS在此处的峰值向低波移动。这一现象也与溶胀度、含水率、溶失率及TG和拉伸结果一致。而随着CMCS的加入酰胺键形成的吸收峰向低波数移动,且665 cm-1处的酰胺Ⅳ说明共混材料体系中无规线团结构增加,即CMCS的存在。

图6给出了交联与未交联的SF/CMCS共混材料红外光谱图。从图6可以看到,交联后的SF/CMCS共混材料在1690 cm-1和1563 cm-1出现两个新的吸收峰。1690 cm-1的吸收峰为戊二醛-CHO的强特征峰。1563 cm-1吸收峰为CN的伸缩振动峰,说明戊二醛的加入使共混材料发生了交联反应。而各个吸收峰均向高波数移动,表明戊二醛加入不但使共混材料发生交联反应,还减少了丝素蛋白分子链与羧基之间形成氢键作用,使共混材料的结构变得更加稳定。

图6   交联与未交联的SF/CMCS共混材料的红外光谱图

Fig.6   FTIR spectra of crosslink and uncrosslink SF/CMCS composites

2.6 SF/CMCS共混材料的SEM分析

图7给出了戊二醛含量为0.2%、SF/CMCS共混材料的扫描电镜图。由图7可见,SF/CMCS复合材料中SF和CMCS之间并未出现明显的相分离,说明SF与CMCS相容性较好;还可以看出,复合材料内部为不规则孔状,孔之间相互贯通,孔径分布较为均匀,孔径大小均分布在50~300 μm,多聚集在100 μm左右,这是二次冻干过程中的冰升华后所留下的空隙。在SF/CMCS共混溶液冷冻时,由于共混溶液中的水温低于冰点而出现过冷却,在热交换作用下产生极小的冰核,只要冷却程度足以使共混溶液相中水的化学势比冰核高,冰核便可成长为较大的冰粒,而周围的共混溶液则相应的被浓缩,使处于无规卷曲结构的SF和CMCS分子间的距离缩短,不同线团上的链段发生互相贯穿,形成了连续的共混溶液相。再将分散在共混相中的冰升华,便得到了多孔状的SF/CMCS共混材料,利于材料和组织结合,也为细胞的长入、水分子及小分子物质的运输提供环境。

图7   再生丝素/羧甲基壳聚糖共混材料的扫描电镜图

Fig.7   SEM images of regenerated fibroin/arboxymethyl chitosan composites A (a)、B (b)、C (c) refer SF/CMCS 2/1, 1/1, 1/2

2.7 组织切片图分析

图8给出了选取的综合物理性能最优的戊二醛含量0.2%、SF:CMCS比为1:1的材料植入小鼠皮下1、2、4周后的组织切片图(黑色箭头指示材料)。由图8可见:植入一周后纤维细胞在植入物周围形成结构不完整的囊壁,有炎细胞产生,且材料与周围组织边界较清晰;植入两周后两种材料中均出现大量的细胞生长,且材料与组织的界限模糊,材料与组织间出现连接,说明材料具有良好的生物相容性。植入材料术后4周,边缘趋于圆润,出现孔洞结构,且质地变形、变软、变小。这表明,材料具有一定的生物降解性。而材料周围形成的纤维囊壁完整、较厚,则由成纤维细胞组成。

图8   复合材料植入皮下的组织切片

Fig.8   The histological observation of composites implanted subcutaneous (a, b, c) the histological observation of composites 1 after operation 1, 2, 4 weeks, (d, e, f) the histological observation of composites 2 after operation 1, 2, 4 weeks

3 结论

用二次冻干法制备的戊二醛交联的新型SF/CMCS复合材料,具有较高的热水溶失率、溶胀度和含水率。当SF和CMCS质量比为1:1、戊二醛含量为0.2%时,该材料的力学性能最优、结晶度增加,热稳定性较高。这种复合材料具有相互连通的多孔结构,孔径适合营养物质和水分子的运输以及细胞的生长,有利于材料与组织结合。这种材料还具有良好的生物相容性和可降解性能。

The authors have declared that no competing interests exist.


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